生物體液中夾竹桃苷和夾竹桃苷乙的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢驗方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物樣品檢驗領(lǐng)域，具體涉及生物體液中夾竹桃苷和夾竹桃苷乙的液 相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢驗方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 夾竹桃（Neriumindicum. Mill)為夾竹桃屬常綠灌木?，F(xiàn)代醫(yī)學研宄證明，夾竹 桃味苦性寒，具有強心、利尿、抗癌、抗炎、鎮(zhèn)靜安神等作用，但是夾竹桃的葉皮根花均有 毒，日常生活當中，常因藥用或誤服過量夾竹桃而出現(xiàn)頭痛、頭暈、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、 譫語、甚則汗出肢厥、心律失常、直至休克死亡。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提供生物體液中夾竹桃苷和夾竹桃苷乙的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢驗方法， 適用于生物樣品（血、尿、肝、腎等）中夾竹桃苷和夾竹桃苷乙的定性定量檢驗，也適用于體 外樣品和可疑物證的檢驗。
[0004] 本發(fā)明的原理是以空白樣品和添加樣品作對照，按平行操作的要求，對體液樣品 樣進行提取、凈化及濃縮，用LC-MS/MS進行檢測，以保留時間（Rt)、質(zhì)譜特征離子碎片峰和 相對豐度作為定性判斷依據(jù)；與平行操作的添加標準品響應值比較，根據(jù)峰面積之比，用外 標法進行定量分析。
[0005] 具體的，本發(fā)明一方面的目的在于提供生物體液中夾竹桃苷和夾竹桃苷乙的液相 色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢驗方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0006] a)取液體樣品或組織樣品剪碎于具塞試管中；取上述制備好的樣品，加入 5. 0-10.0 mL的乙酸乙醋兩次，每次振蕩lOmin，離心10min，合并兩次有機相，空氣濃縮儀上 濃縮至0. 5mL，過0. 22 μ m微孔有機濾膜，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析；
[0007] b)樣品分析：
[0008] 色譜柱：kinetex C18 ;柱溫：40°C ;進樣量：10 μ L ;流動相：A為乙腈，B為用甲酸 調(diào)節(jié)pH為3. 5的IOmM甲酸按水溶液（本發(fā)明中：IOmM甲酸按水溶液是指甲酸按的濃度 為10mmol/L，用甲酸調(diào)節(jié)其pH為3. 5,以下不再贅述）；梯度洗脫：0. 2min，A為10%，B為 90%;3· 0min，A 為 95%，B 為 5%;5· 0min，A 為 95%，B 為 5%;5· lmin，A 為 10%，B 為 90%; 7. Omin，A 為 10%，B 為 90% ;流速為 0· 5mL/min ;
[0009] 離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描（ESI+);檢測方式：多反應監(jiān)測 (MRM)，兩對離子對定性，其中一對離子對定量；電噴霧電壓：5500V ;離子源溫度：550°C ;霧 化氣壓力：55psi ;氣簾氣壓力：35psi ;輔助氣壓力：55psi。
[0010] 優(yōu)選地，上述乙酸乙酯的加入量為5. OmL-10.0 mL。
[0011] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，尤其是對于新鮮血液樣品，其中a)樣品前處理還 能夠替換為：移取液體樣品，加入的PH5. 8磷酸鹽緩沖液，混勻后，將樣品加入固相支撐液 液萃取柱中，用正壓將樣品壓入柱中，靜置5min，將乙酸乙酯分兩次加入到萃取柱中，流速 為0. 5mL/min~1.0 mL/min ;再將柱中殘余的液體擠出；萃取完畢后，將萃取液用氮氣流吹 至干，然后用初始流動相定容至〇. 5mL，過0. 22 μ m微孔有機濾膜，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì) 譜儀分析。
[0012] 優(yōu)選地，上述pH5. 8磷酸鹽緩沖液的加入量為0. 5mL ;優(yōu)選地，上述乙酸乙酯的加 入量為8mL。
[0013] 在本發(fā)明的一個具體的實施方式中，其中a)樣品前處理步驟中，還包括另取3份 相同基質(zhì)的空白樣品，1份作為空白樣品，另2份添加夾竹桃苷和夾竹桃苷乙混標0.1 yg作 為添加樣品；或者還包括準確量取液體樣品1.0 mL~2. OmL或均衆(zhòng)后的固體樣品1.0 g~ 2. Og，添加有機磷標準品混標，混勻。
[0014] 在本發(fā)明的一個具體的實施方式中，液體樣品為血液、尿液、唾液；所述組織樣品 為肝臟、腎臟。
[0015] 在本發(fā)明的一個具體的實施方式中，C18柱為3. 0mmX50mm，2. 6 μπι柱。
[0016] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，取液體樣品1.0mL-2. OmL;或者組織樣品 1.0 g-2. 0g〇
[0017] 本發(fā)明另一方面的目的在于提供生物體液中夾竹桃苷和夾竹桃苷乙的液相色 譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢驗方法的應用，應用于法庭科學領(lǐng)域，尤其是應用于生物樣品中夾竹桃苷 和夾竹桃苷乙的定性定量檢驗，以及適用于體外樣品和可疑物證的檢驗。
[0018] 優(yōu)選地，所述生物樣品為血、尿、肝、腎。
[0019] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明樣品處理采用液液萃取或者固相萃取，操作簡單， 樣品用量少；采用LC-MS/MS靈敏度高，能有效的排除假陽性，定性、定量準確度高。
【附圖說明】
[0020] 圖1表示夾竹桃苷質(zhì)譜圖；
[0021] 圖2表示夾竹桃苷乙質(zhì)譜圖；
[0022] 圖3A和圖3B表示夾竹桃苷MRM離子色譜圖；
[0023] 圖4A和圖4B表示夾竹桃苷乙MRM離子色譜圖。
【具體實施方式】
[0024] 實施例1定性分析
[0025] 1、試劑
[0026] 本發(fā)明除有說明外所用試劑均為分析純，試驗用水為三級水（見GB/T 6682-2008 規(guī)定）；
[0027] 乙腈：色譜純；
[0028] 甲醇：色譜純；
[0029] 甲酸：色譜純；
[0030] 甲酸銨：色譜純；
[0031] 磷酸鹽緩沖液（pH 5. 8):取磷酸二氫鉀8. 34g與磷酸氫二鉀0. 87g，分別置于 1000 mL容量瓶中，加一級水溶解、稀釋至刻度；
[0032] 純水（電阻率彡18ΜΩ · CM)。
[0033] 液液支撐固相萃取柱，60mg，lmL。
[0034] 有機濾膜，0.22 μ m。
[0035] 標準溶液：
[0036] 1)夾竹桃苷和夾竹桃苷乙儲備液：精確稱取夾竹桃苷和夾竹桃苷乙標準品各 l〇mg，分別于IOmL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，配制成1.0 mg/mL鉤吻素甲和 鉤吻素子標準儲備液，冷藏保存6個月；
[0037] 2)夾竹桃苷和夾竹桃苷乙標準工作液：精確量取1.0 mg/mL夾竹桃苷和夾竹桃苷 乙標準儲備液各lmL，分別于IOmL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成0. lOmg/mL的夾竹 桃苷和夾竹桃苷乙標準工作液，冷藏保存1個月。試驗中所用其它濃度的標準溶液均從上 述儲備溶液用甲醇稀釋而得，冷藏保存為1個月。
[0038] 2、儀器和材料
[0039] a)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀；
[0040] b)電子分析天平：感量為0· OOOlg和0· Olg ;
[0041 ] c)尚速振湯器；
[0042] d)高速離心機；
[0043] e)勻漿機；
[0044] f)濃縮儀；
[0045] j)渦旋混合器；
[0046] h)微量移液器：量程 5 μ L ~100 μ L, 100 μ L ~1000 μ L ;
[0047] i)微孔濾膜：0·22μπι;
[0048] 3、樣品萃取
[0049] 3. 1、液液萃取
[0050] 取血液等液體樣品1.0 mL~2. OmU或肝臟等固體樣品（勻漿后）1.0 g~2. Og于 具塞試管中，另取3份相同基質(zhì)的等量空白樣品于具塞試管中，1份作為空白樣品，另2份添 加有夾竹桃昔和夾竹桃昔乙混標〇. I y g作為添加樣品。
[0051] 取上述制備好的樣品，加入5. 0-10.0 mL的乙酸乙酯兩次，每次振蕩lOmin，離心 lOmin，合并兩次有機相，空氣濃縮儀上濃縮至0. 5mL，過0. 22 μ m微孔有機濾膜，濾液供液 相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。
[0052] 3. 2、固相萃?。ㄟm用于新鮮血液）
[0053] 移取血液0. 5mL，加入0. 5mL的pH5. 8磷酸鹽緩沖液，混勻后，將樣品加入固相支 撐液液萃取柱中，用正壓將樣品壓入柱中，靜置5min，將SmL乙酸乙酯分兩次加入到萃取 柱中，流速為〇. 5mL/min~1.0 mL/min ;再將柱中殘余的液體擠出；萃取完畢后，將萃取液用 氮氣流吹至干，然后用初始流動相定容至0. 5mL，過0. 22 μ m微孔有機濾膜，濾液供液相色 譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。
[0054] 4、儀器檢測
[0055] 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀條件
[0056] 以下為參考條件，可根據(jù)不同品牌儀器和不同樣品等實際情況進行調(diào)整：
[0057] a)色譜柱：kinetex C18 (3. OmmX 50mm，2. 6 μ m)柱；
[0058] b)柱溫：40°C
[0059] c)流動相：流動相：A :乙腈，B :用甲酸調(diào)節(jié)pH為3. 5的IOmM甲酸銨水溶液，梯度 見表1。
[0060] d)流速：0· 5mT ,/mi η
[0061] e)進樣體積：10 μ L
[0062] 表1流動相梯度
[0063]
[0064] MS 條件
[0065] 掃描方式：ESI+ ;檢測方式：MRM，兩對離子對定性，其中一對離子對定量。
[0066] 離子源溫度：550°C ;霧化氣壓力55psi ;
[0067] 電噴霧電壓：5500V ;氣簾氣壓力：35psi ;輔助氣壓力：55psi。
[0068] 離子對質(zhì)譜參數(shù)見表2。
[0069] 表2質(zhì)譜參數(shù)
[0070]
[0071] 5、記錄和計算
[0072] 記錄各樣品及標準品平行進樣2~3次中目標物的保留時間及峰面積值，按公式 (1)計算回收率：
[0073]
[0074] 式中：
[0075] R-回收率；
[0076] A添一添加樣品中標準物質(zhì)的峰面積平均值；
[0077] W純一標準物質(zhì)濃度，單位為微克每毫升（μ g/mL);
[0078] V添一添加樣品的定容體積，單位為毫升（mL);
[0079] A純一標準物質(zhì)的峰面積平均值；
[0080] M添一添加樣品中標準物質(zhì)的添加量，單位為微克（μ g)。
[0081] 6、定性結(jié)果評價
[0082] 6.1、陰性結(jié)果評價
[0083] 在LC-MS/MS分析中，如果檢材樣品未出現(xiàn)與標準物質(zhì)Rt值相同的色譜峰，添加樣 品的回收率在60 %以上，則陰性結(jié)果可靠。
[0084] 如果添加樣品中未出現(xiàn)與標準物質(zhì)Rt值相同的色譜峰或回收率低于60%，則陰 性結(jié)果不可靠。
[0085] 本發(fā)明的方法在血液、尿液等檢材樣品中夾竹桃苷、夾竹桃苷乙的檢出限為 0. 5ng/mL〇
[0086] 6. 2陽性結(jié)果評價
[0087] 如果案件樣品與標準品Rt值比較，保留時間偏差在±2. 5%之內(nèi)，且質(zhì)譜特征離 子碎片（或定性離子對）與添加樣品中的相對豐度比之相對誤差不超過表3規(guī)定的范圍， 空白樣品無干擾，則陽性結(jié)果可靠。
[0088] 表3定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差
[0089]
[0090^-如果空白樣品出現(xiàn)與標準品Rt值相同的色譜峰，且質(zhì)譜特征離子碎片（或定性離 子對）及相對豐度一致，則陽性結(jié)果不可靠。相關(guān)質(zhì)譜圖參見圖1-圖4。實施例2定量分 析
[0091] 1、試劑同實施例1
[0092] 2、儀器與材料同實施例1
[0093] 3、樣品萃取
[0094] 準確量取血液等液體樣品LOmL~2. OmL或稱取勻漿后的肝臟等固體樣品 1. Og~2. Og各3份，1份作為空白樣品，另2份添加有機磷標準品混標，混勻。其他同實施 例1〇
[0095] 4、儀器檢測同實施例1
[0096] 5、記錄和計算
[0097] 5. 1、外標法計算藥物含量
[0098] 記錄各樣品平行進樣2~3次中目標物峰面積值，按公式（2)計算含量：
[0099]
[0100] 式中：
[0101] W-單位質(zhì)量樣品中目標物質(zhì)的含量，單位為微克每克（μ g/g)或微克每毫升 (μ g/mL)；
[0102] A樣一樣品中目標物的峰面積平均值；
[0103] M添一添加樣品中標準物質(zhì)的添加量，單位為微克（μ g);
[0104