細(xì)管色譜柱（30m)、溫度程序?yàn)?0°C下恒溫2min，然后 以15°C /min的速率升溫到325°C，恒溫6min、傳輸線溫度為250°C。
[0039] 質(zhì)譜參數(shù)為：離子源溫度為250°C、質(zhì)量掃描范圍為70-600m/z、采集速率每秒20 個掃描、質(zhì)譜電子轟擊源燈絲開啟時間在色譜溶劑延遲170s后、檢測器電壓1700-1850V、 質(zhì)譜虧損設(shè)置為0、燈絲偏置電流為70V、儀器自動調(diào)諧。
[0040] 數(shù)據(jù)處理工作站的譜圖調(diào)整的參數(shù)設(shè)置：
[0041] 譜圖解卷積參數(shù)為：力可公司自帶的商業(yè)軟件Chroma T0F、基線消除 (Baseline Offset)設(shè)置 1(0. 5-1)、譜圖平滑（Smoothing)數(shù)據(jù)點(diǎn) 5 (3-7)、峰寬（Peak Width) 3s (3s-4s)、信噪比 S/N(Signal-Tonoise Ratio) 10(2-15).
[0042] 通過Nist. 08數(shù)據(jù)庫的分析對比得到分析結(jié)果，表1為四種不同提取方法提取情 況表。
[0043]表1
[0044]
[0045] 表 2
[0046]
[0047] 表 3
[0048]
[0049] 表 4
[0050]
[0053] 從表1-表5可以看出：使用提取混合液-微波萃取的方法提取出的斑馬魚代謝物 平均有64種，其包含氨基酸、糖類以及糖類衍生物、油脂類物質(zhì)以及小分子酸和部分烷烴、 烯烴醇類等，種類分布較均勻，其余三種方法提取的物質(zhì)種類平均在60種以內(nèi)，且偏差較 大；四種方法檢測出的氨基酸、部分脂類、糖類和小分子酸在種類上差別不大，但是使用方 法一可全面檢測出三種糖類：葡萄糖，甘露糖以及果糖，其余方法卻并不穩(wěn)定；另外本方法 可以檢測出烷烴和烯烴的存在，其余三種方法并未檢出；另外作為生物代謝的重要物質(zhì)乳 酸，僅有第一種方法能穩(wěn)定檢測分析出，其余方法出現(xiàn)乳酸的機(jī)會隨機(jī)或響應(yīng)不高。
[0054] 所述斑馬魚代謝物的提取方法的應(yīng)用，用于斑馬魚納米毒性檢測，方法如下：挑 選健康成年斑馬魚，將其均勻分為四組，其中三組分別加入〇.〇lmg/L的氧化石墨烯、碳納 米管、量子點(diǎn)氧化石墨烯溶液三種納米材料中染毒，另一組放入不加入任何納米材料的鹽 水中，每日換水喂食，27°C養(yǎng)育21d ;然后分別按照斑馬魚代謝物的提取方法的五個步驟操 作，將得到斑馬魚代謝物衍生化樣品并轉(zhuǎn)移到適合GC-MS分析的內(nèi)襯管中保存。將得到的 四組樣品按照與前述相同的方法進(jìn)行分析。表2為三種不同的納米材料染毒和對照組經(jīng)過 提取后代謝物提取情況（單位：峰面積/〇. lg組織）。
[0055] 表 6
[0057] 表 7
[0058]
[0059] 表 8
[0060]
[0061] 表 9
[0062]
[0063] 表 10
[0064]
[0065] 從表4中可以看出：使用該提取方法得到的數(shù)據(jù)中肌酐的變化顯著，可用于評估 魚類腎功能的情況；表1中鳥氨酸的顯著變化也可以預(yù)示斑馬魚體內(nèi)代謝情況的改變；但 是在總超氧化物歧化酶和丙二醛等酶活指標(biāo)測量的結(jié)果中這種差異并不十分明顯。
[0066]圖1是同一批次染毒的斑馬魚成魚的總超氧化物歧化酶活性對比圖，圖中表明： 與對照組的斑馬魚相比，經(jīng)過三種納米材料處理的斑馬魚的總超氧化物歧化酶活性并沒有 顯著的變化。。
[0067] 圖2是同一批次染毒的斑馬魚成魚的丙二醛含量對比圖，圖中表明：與對照組的 斑馬魚相比，經(jīng)過三種納米材料處理的斑馬魚的丙二醛含量并沒有顯著變化。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種斑馬魚代謝物的提取方法，其特征在于步驟如下： 1) 將斑馬魚樣品用生理鹽水沖洗干凈后準(zhǔn)確稱重，然后迅速浸沒于液氮中保存?zhèn)溆茫? 2) 將上述斑馬魚樣品置于盛有液氮的研缽中在_80°C溫度下研磨5分鐘至斑馬魚組織 變成勻質(zhì)漿體； 3) 將上述漿體狀斑馬魚樣品加入_20°C預(yù)冷的提取液中，在40°C溫度下微波萃取30分 鐘，微波萃取功率為（樣品罐數(shù)+2)X100W，離心后收集第一次上清液，然后在固體殘留物 中再加入相同量的上述_20°C的提取液，繼續(xù)在40°C溫度下微波萃取30分鐘，離心后收集 第二次上清液； 4) 將第一次上清液與第二次上清液混合，在混合液中加入滅菌去離子水，4000rpm下 離心5分鐘，靜置5分鐘后溶液分層，上層溶液是甲醇/水相，下層溶液為氯仿相，兩相分離 后將氯仿相用氮?dú)獯蹈?，然后將甲?水相轉(zhuǎn)移至已干燥的氯仿相中，得到混合溶液； 5) 將上述混合溶液放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)以_30°C- -50°C真空干燥后，采用兩步法進(jìn)行 衍生化：首先加入濃度為20mg/mL的甲氧氨基鹽酸鹽-吡啶溶液，密封后渦旋1分鐘，后將 其在3000rpm下離心1分鐘，再在30°C下溫浴90分鐘，然后加入硅烷化試劑N-甲基-N-(三 甲基硅烷）-三氟乙酰胺（MSTFA)，37°C下溫浴30分鐘，得到斑馬魚代謝物衍生化樣品并轉(zhuǎn) 移到適合GC-MS分析的內(nèi)襯管中保存。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述斑馬魚代謝物的提取方法，其特征在于：所述步驟3)提取液為 甲醇、氯仿與水的混合液，混合液中甲醇、氯仿與水的體積比為2. 5:1:1，其中甲醇、氯仿與 水均為色譜純；斑馬魚樣品與提取液的用量比為0. 3-0. 5g:15mL。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述斑馬魚代謝物的提取方法，其特征在于：所述步驟4)中斑馬魚 樣品與滅菌去離子水的用量比為0. 3-0. 5g:500yL。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述斑馬魚代謝物的提取方法，其特征在于：所述步驟5)中斑馬魚 樣品與甲氧氨基鹽酸鹽-吡啶溶液的用量比為〇. 3-0. 5g:50yL，斑馬魚樣品與硅烷化試劑 的用量比為〇? 3-0. 5g:80yL。5. -種如權(quán)利要求1所述斑馬魚代謝物的提取方法的應(yīng)用，用于斑馬魚納米毒性檢 測。
【專利摘要】一種斑馬魚代謝物的提取方法，步驟如下：1)將斑馬魚樣品用生理鹽水沖洗干凈后迅速浸沒于液氮中保存?zhèn)溆茫?)將樣品在-80℃溫度下研磨變成勻質(zhì)漿體；3)將漿體狀樣品加入-20℃預(yù)冷的提取液中，進(jìn)行兩次微波萃取，將離心后收集兩次上清液混合后加入滅菌去離子水，經(jīng)離心、靜置、干燥后得到混合溶液；4)將混合溶液真空干燥后，通過甲氧氨基鹽酸鹽-吡啶溶液、N-甲基-N-(三甲基硅烷)-三氟乙酰胺兩步法進(jìn)行衍生化，得到斑馬魚代謝物衍生化樣品。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：該斑馬魚代謝物的提取方法簡單、準(zhǔn)確，易于實(shí)施，用于斑馬魚暴露于低濃度納米材料實(shí)驗(yàn)，可使斑馬魚毒性檢測的靈敏性提高。
【IPC分類】G01N33/50, G01N27/62, G01N1/34
【公開號】CN104931326
【申請?zhí)枴緾N201510387669
【發(fā)明人】孫晶, 胡獻(xiàn)剛, 周啟星
【申請人】南開大學(xué)
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年7月3日