堿酯酶為蛋白質(zhì)分子，屏蔽了電極表面的電活性，阻礙了電子傳遞，因而峰電流出現(xiàn)了減小的趨勢(shì)。
[0022]圖3 pH對(duì)電流變化的影響
測(cè)試底液的PH值是影響傳感器性能的關(guān)鍵因素之一。AChE的最適pH值為7.0到8.0之間。將AChE/DCHP-MWCNTs/SPE電極在不同pH值(6到8)的含有1.0mmoI/L氯化硫代乙酰膽堿(ATCl)的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行電流響應(yīng)的測(cè)試；如圖3所示，響應(yīng)電流隨pH的變化而變化。PH值在6.0-7.5之間，響應(yīng)電流隨pH的增大而增加；pH值在7.5-8.0之間，響應(yīng)電流隨pH的增大而減小。所以，選擇pH值為7.5為最佳測(cè)定pH值。
[0023]圖4酶負(fù)載量對(duì)酶?jìng)鞲衅麟娏髯兓挠绊?br> 乙酰膽堿酯酶在電極表面固定的量也是影響傳感器性能的因素之一。如圖4所示，隨著酶負(fù)載量的增加，響應(yīng)電流先增大后減小。在酶負(fù)載量為0.25U是達(dá)到最大值。酶負(fù)載量小于0.25U時(shí)，響應(yīng)電流隨著乙酰膽堿酯酶負(fù)載量的增加而增大；但是，當(dāng)酶負(fù)載量大于0.25U時(shí)，隨著乙酰膽堿酯酶負(fù)載量的增加，響應(yīng)電流趨于穩(wěn)定，并有略微減小的趨勢(shì)，這是由于有限的電極面積使得大量的酶在電極表面堆積，影響了電子的傳輸。因此，我們選擇
0.25U作為最佳乙酰膽堿酯酶固定量，因此，在試驗(yàn)中固定在電極表面的乙酰膽堿酯酶的量為 0.25U。
[0024]圖5氯化乙酰硫代膽堿濃度對(duì)酶?jìng)鞲衅麟娏髯兓挠绊?a.0.5mM; b.1mM;c.2mM; d.5mM; e.8mM; f.1OmM
將制備好的AChE/DCHP-MWCNTs/SPE傳感器浸入一系列不同濃度的氯化硫代乙酰膽堿(ATCl)溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，如圖5所示，隨著底物濃度的增加，峰電流相應(yīng)增加。說(shuō)明界面固定的AChE能迅速結(jié)合溶液中的氯化硫代乙酰膽堿(ATCl)并催化其水解。
[0025]圖6掃描速率對(duì)酶?jìng)鞲衅麟娏髯兓挠绊?a.5mV; b.1OmV; c.20mV; d.40mV; e.80mV; f.1OOmV; g.150mV; h.200mV 我們用循環(huán)伏安法進(jìn)一步研宄了掃描速率對(duì)AChE/DCHP-MWCNTs/SPE在含有1.0mmol/L pH7.5氯化硫代乙酰膽堿(ATCl)的磷酸鹽緩沖液中電化學(xué)行為的影響，如圖6所示:在5~200mV/s范圍內(nèi)，隨著掃速的增加，峰電流逐漸增大，掃描速率的變化與電流變化正相關(guān)，表明電極掃描速率變化是表面控制過(guò)程。
[0026]圖7農(nóng)藥濃度對(duì)酶?jìng)鞲衅麟娏髯兓挠绊?a.1 X 15 μ g/L; b.1 X 13 μ g/L;c.5X 12 μ g/L; d.2X 12 μ g/L; e.1 X 12 μ g/L; f.10 μ g/L; g.5 μ g/L; h.1 μ g/L; 1.5 μ g/L; j.0.05 μ g/L
固定在電極表面的毒死蜱濃度對(duì)酶?jìng)鞲衅鞯男阅苡泻艽笥绊憽?br>[0027]圖7顯示了電極表面修飾不同濃度毒死蜱的電流變化。隨著毒死蜱濃度的增加，電流變化率逐漸增加。
[0028]圖8農(nóng)藥濃度對(duì)酶?jìng)鞲衅麟娏髯兓挠绊?br> 如圖8所示，不同濃度的毒死蜱對(duì)乙酰膽堿酯酶有不同的抑制率。在最優(yōu)條件下，毒死蜱在0.05-1 X 15 μ g/L濃度范圍內(nèi)與農(nóng)藥的抑制率有較好的線性關(guān)系，線性方程為:y=4.1765x+4.9171，相關(guān)系數(shù)為 0.9918。
[0029]圖9 AChE/IL-MWCNTs/SPE傳感器實(shí)際樣品加標(biāo)回收率檢測(cè)
從當(dāng)?shù)爻匈?gòu)買新鮮蔬菜，去除腐爛的葉片，并清洗干凈。待蔬菜晾干后，切成2X2_的小葉片，稱取2g葉片于小燒杯中，在蔬菜表面噴灑10 μ g/L毒死蜱，室溫下放置3h。然后加入ImL丙酮和9mL 0.lmol/L pH7.5的磷酸鹽緩沖液，將懸浮液超聲15min后于離心機(jī)中轉(zhuǎn)速為100rpm離心lOmin，取上清液直接測(cè)量，不需要提取和富集。樣品中農(nóng)藥的濃度根據(jù)校正曲線算出；
采用基于鄰苯二甲酸二環(huán)己酯-多壁碳納米管納米復(fù)合物修飾的絲網(wǎng)印刷電極乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅鲗?duì)實(shí)際樣品(卷心菜、生菜、韭菜、小白菜)進(jìn)行加標(biāo)回收率的檢測(cè)，如圖9所示，回收率位于98.9%~105.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.56%~4.12%，表明該酶?jìng)鞲衅鞯膶?shí)際樣品檢測(cè)效果良好。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。
[0031]實(shí)施例1:一種基于絲網(wǎng)印刷碳電極的傳感器制備方法
(1)電流型乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅髦苽淝敖z網(wǎng)印刷碳電極的清洗，將絲網(wǎng)印刷碳電極置于ImM NaOH溶液中超聲5min，超純水沖洗，N2吹干。之后，將電極置于ImM HCl溶液中超聲5min，超純水沖洗，N2吹干。最后，用無(wú)水乙醇沖洗電極，N2吹干；
(2)電流型乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅髦苽淝半姌O的活化，在pH5.0磷酸鹽緩沖液中掃描電流-時(shí)間曲線300s，之后掃描循環(huán)伏安曲線直至性能穩(wěn)定；
(3)鄰苯二甲酸二環(huán)己酯/多壁碳納米管的制備，將0.1g殼聚糖加入到50mL濃度為
1.0%乙酸溶液中，配成濃度為0.2%的殼聚糖溶液，磁力攪拌8h以上使殼聚糖完全溶解。將2mg鄰苯二甲酸二環(huán)己酯分散于4mL濃度為0.2%的殼聚糖溶液中，并在65°C水浴中超聲分散以得到穩(wěn)定的分散液；所獲得的高度分散懸浮液為0.5mg/mL鄰苯二甲酸二環(huán)己酯溶液；將2mg多壁碳納米管分散于4mL 0.2%的殼聚糖溶液中，并在室溫下超聲分散6h以得到穩(wěn)定的黑色分散液。所獲得的高度分散黑色懸浮液為0.5mg/mL多壁碳納米管-殼聚糖納米復(fù)合物，將制備好的多壁碳納米管溶液在4°C下存儲(chǔ)；
(4)將5~10 yL的鄰苯二甲酸二環(huán)己酯滴涂在預(yù)處理絲網(wǎng)印刷碳電極上，在空氣中干燥，用超純水沖洗表面，將未固定在電極表面的鄰苯二甲酸二環(huán)己酯沖洗掉，得到鄰苯二甲酸二環(huán)己酯修飾的絲網(wǎng)印刷碳電極；之后，將5~10 yL多壁碳納米管溶液滴涂在得到的離子液體修飾的絲網(wǎng)印刷碳電極中工作電極表面，在空氣中干燥，用超純水沖洗表面，將未固定在電極表面的多壁碳納米管溶液沖洗掉，得到鄰苯二甲酸二環(huán)己酯-多壁碳納米管修飾的絲網(wǎng)印刷碳電極；然后滴涂5~10 μ L乙酰膽堿酯酶溶液，并在4°C下干燥。用pH為7.5的磷酸鹽緩沖溶液沖洗去除未吸附上的酶，這樣就得到AChE/DCHP-MWCNTs/SPE傳感器，在4°C干燥環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?br>[0032]實(shí)施例2:利用所制備的電流型乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)蔬菜樣品
(1)將按照實(shí)施例1制備好的乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅髟诤?.0mM的氯化硫代乙酰膽堿(ATCl)的pH7.5的磷酸鹽緩沖溶液中以50mV/s掃描速度進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)試，電位窗口為0V-1.0V ；
(2)配置毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液，農(nóng)藥測(cè)量時(shí)，將上述乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅鹘氲讲煌瑵舛鹊霓r(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液中l(wèi)Omin，然后在反應(yīng)池中加入15~20mL含有1.0mM氯化硫代乙酰膽堿(ATCl)的磷酸鹽緩沖溶液，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，抑制率I可由下式求得:
I (%) - (Ip； contro1-1 P，exp)/ip，control ^ 100%
其中IP，eontrol^Ip, _分別為修飾電極未經(jīng)過(guò)農(nóng)藥抑制和經(jīng)過(guò)農(nóng)藥抑制后，在氯化硫代乙酰膽堿溶液中的峰電流，農(nóng)藥濃度與抑制率呈一定的線性關(guān)系，做出工作曲線圖，得到農(nóng)藥濃度與抑制率之間的線性關(guān)系，以及檢測(cè)限；
(3)乙酰膽堿酯