10mg:0.025-0.125mL，充分混勻后再加入與蛋白溶解液A相同體積的蛋白溶解液B，離心，取上清即為標(biāo)準(zhǔn)品；
[0038]所述蛋白溶解液A為50 % -80 %的色譜級甲酸，蛋白溶解液B為色譜級乙腈。
[0039]進(jìn)一步地，步驟⑴中三株菌的質(zhì)量比為4-7:1-4:1-2 ;步驟⑵和步驟(3)的離心均為 10000_13000rpm，2_5min。
[0040]優(yōu)選地，步驟⑴中三株菌的質(zhì)量比為5-6:1-3:1-2 ;步驟⑵和步驟⑶的離心均為 12000rpm，2_3min。
[0041]更優(yōu)選地，步驟(I)中三株菌的質(zhì)量比為5:2:1 ;步驟⑵和步驟(3)的離心均為12000rpm,2_3min。
[0042]本發(fā)明提供的微生物鑒定用質(zhì)譜儀分子量校正標(biāo)準(zhǔn)品，含有大腸桿菌(Escherichia coli)特征蛋白的質(zhì)荷比m/z包括了目前國際上僅有的商業(yè)化微生物鑒定用質(zhì)譜AXIMA Assurance、Microf lex/Auto校正峰列表的全部肽序列。
[0043]采用各自的校正參數(shù)，用本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)蛋白肽質(zhì)量譜進(jìn)行校正，校正結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下:
[0044]德國布魯克公司的Microflex/Auto基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜FlexControl采集軟件中，本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)品肽譜圖與Calibrat1n選項中Ecoil_Standards列表中峰值匹配率達(dá)到該系統(tǒng)設(shè)定要求，自動校正通過，且偏差在300-500ppm之間，即為校正成功。
[0045]日本島津公司的AXIMA Assurance基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜Launchpad采集軟件中，本發(fā)明標(biāo)準(zhǔn)肽譜與Calibrat1n references選項中ECAL alpha校正文件中各峰值匹配率達(dá)到系統(tǒng)設(shè)定要求，漏配峰不高于3個，偏差小于500ppm，即為校正成功。
[0046]本發(fā)明基于基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜技術(shù)，通過對85株大腸桿菌肽質(zhì)量譜的比對、對多種大腸桿菌的組合與優(yōu)化，提供一種依據(jù)多種大腸桿菌的優(yōu)化肽序列，以該序列譜為基礎(chǔ)構(gòu)建適用于目前商業(yè)化質(zhì)譜微生物鑒定系統(tǒng)的校正標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明優(yōu)化篩選出了 3株大腸桿菌，經(jīng)過配比優(yōu)化確定了標(biāo)準(zhǔn)品母株組合及其最佳配比。進(jìn)一步地，通過確定標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與比例，提高標(biāo)準(zhǔn)品肽質(zhì)量譜的敏感性。根據(jù)上述方法構(gòu)建的質(zhì)譜儀分子量校正標(biāo)準(zhǔn)品，其制備成本低廉、校正譜圖優(yōu)質(zhì)、校正效果穩(wěn)定，用于國際上商業(yè)化的、用于微生物鑒定的基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜儀，均能獲得優(yōu)質(zhì)的校正譜圖，校正效果、穩(wěn)定性優(yōu)于常規(guī)的校正方法，填補(bǔ)目前微生物鑒定用質(zhì)譜儀分子量校正標(biāo)準(zhǔn)品商業(yè)化的國內(nèi)空白，彌補(bǔ)了校正過程費時、費力且效果不穩(wěn)定等不足之處，適合推廣使用。
【附圖說明】
[0047]圖1為9株目標(biāo)菌株的肽質(zhì)量譜(2000-20000Da)，圖中星標(biāo)的MG1655、JM109、ATCC8739為選定的標(biāo)準(zhǔn)品母株。圈起部分為其被選為母株的特征部分。
[0048]圖2為Microflex系統(tǒng)譜圖，其中A圖為大腸桿菌8739按布魯克公司蛋白處理流程采集的譜圖；B圖為本發(fā)明標(biāo)準(zhǔn)品的譜圖。
[0049]圖3為標(biāo)準(zhǔn)蛋白穩(wěn)定性測試譜圖，圖中1-12分別代表1-12個月。
【具體實施方式】
[0050]以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0051]若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例中所用的試劑為市售。
[0052]實施例1標(biāo)準(zhǔn)品母株的優(yōu)化與確定
[0053]選擇85株大腸桿菌菌株，包括標(biāo)準(zhǔn)菌株及野生株。采用FlexAnalysis軟件對85株大腸桿菌的2000-20000Da的肽質(zhì)量譜進(jìn)行分析，從肽數(shù)目、覆蓋范圍、信噪比幾方面對85株菌進(jìn)行綜合分析:肽數(shù)目大于50個，質(zhì)荷比范圍(2000-5000Da、5000-8000Da、8000-16000Da)具有優(yōu)勢，信噪比大于5的菌株被選定為母株，據(jù)此，鎖定了 9株目標(biāo)菌株(圖1)。根據(jù)肽譜質(zhì)量范圍分布將9株菌分為4組，通過優(yōu)化各組分百分比確定最佳肽質(zhì)量譜，最終確定3株菌MG1655、JM109、ATCC8739為標(biāo)準(zhǔn)品母株(圖1)。ATCC8739、MG043、JMO12三者的質(zhì)量比例為3-8:1-5:1-3。通過實驗發(fā)現(xiàn)，更優(yōu)的質(zhì)量比例為4_7:1_4:1_2，最優(yōu)的質(zhì)量比例為5-6:1-3:1-2。
[0054]上述最佳配比的3株標(biāo)準(zhǔn)品母株混合后，其特征蛋白的質(zhì)荷比m/z分別為:2094，2466，3149，4364，5095，5380，6241，6254，6315，6410，6856，7157，7273，7872，8368，9742，10137，10299，12227。
[0055]實施例2微生物鑒定用質(zhì)譜儀分子量校正標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0056](I)蛋白溶解液甲酸百分比優(yōu)化
[0057]按比例取適量(5-10mg)標(biāo)準(zhǔn)品母株5:2:1 (ATCC8739、MG1655、JM109)對數(shù)期菌落，加入0.1-0.5mL超純水(即蛋白洗滌液A)，仔細(xì)混勻；再加入與蛋白洗滌液A體積比5-2:1的無水乙醇(蛋白洗滌液B)，仔細(xì)混勻。12，OOOrpm離心2分鐘，棄去上清(必要時，再離心一次盡量去除乙醇和水)。加入0.25-0.125mL以下百分比的甲酸，仔細(xì)混勻，再加入0.25-0.125mL 100%的乙腈，仔細(xì)混勻，12000rpm離心2分鐘，上清即為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。在標(biāo)準(zhǔn)品蛋白制備過程中，蛋白溶解液中甲酸的濃度選擇影響肽譜質(zhì)量。將體系中甲酸濃度設(shè)定為40%、50%、60%、70%、80%、90%六個梯度進(jìn)行優(yōu)化。采用布魯克公司的Micrflex LT質(zhì)譜儀進(jìn)行采樣。固定激光強(qiáng)度為42，采集shots疊加總數(shù)為500。最終譜圖的強(qiáng)度值顯示50%-80%的甲酸濃度時，標(biāo)準(zhǔn)品肽質(zhì)量譜強(qiáng)度在1.2-1.8X 14之間，質(zhì)量均較好，優(yōu)以50% -70%的甲酸為最好，適合于校正用。
[0058](2)基質(zhì)溶解液中三氟乙酸濃度優(yōu)化
[0059]標(biāo)準(zhǔn)蛋白在樣本靶上與基質(zhì)結(jié)合后的結(jié)晶狀態(tài)，直接影響肽質(zhì)量譜的質(zhì)量。將基質(zhì)溶解液中三氟乙酸濃度設(shè)定為0.5%Α.0%Λ.5%,2.0%、2.5%,3.0%、3.5%,4.0%等8個梯度進(jìn)行優(yōu)化。采用布魯克公司的Micrf lex LT質(zhì)譜儀進(jìn)行采樣。固定激光強(qiáng)度為42，采集shots疊加總數(shù)為500。根據(jù)各濃度的譜圖強(qiáng)度評價確定最優(yōu)濃度。0.5%-4.0%三氟乙酸對應(yīng)的各譜圖的強(qiáng)度依次為4000、8000、8000、12500、8000、8000、9000,2.0%的體系標(biāo)準(zhǔn)品與基質(zhì)結(jié)晶狀態(tài)最佳、采集速度最快、譜圖理想。
[0060](3)本發(fā)明微生物鑒定用質(zhì)譜儀分子量校正標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0061]I)選擇大腸桿菌ATCC8739、MG1655、JM109，將三株菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，收集菌株，按照質(zhì)量比5:2:1將三者混合；
[0062]2)按照質(zhì)量體積比5mg:0.2mL向三株大腸桿菌混合物中加入蛋白洗滌液A，再按照與蛋白洗滌液A的體積比3:1加入蛋白洗滌液B ;混勻、離心、棄上清；
[0063]所述蛋白洗滌液A為去離子水或超純水；蛋白洗滌液B為無水乙醇；
[0064]3)向步驟2)獲得的沉淀中加入蛋白溶解液A，二者的質(zhì)量體積比為5mg:0.1mL, ^分混勻后再加入與蛋白溶解液A相同體積的蛋白溶解液B，離心，取上清即為標(biāo)準(zhǔn)品成品；也可將上清按每管20 μ L分裝凍干。上述蛋白溶解液A為50% -80%的色譜級甲酸，蛋白溶解液B為色譜級乙腈。
[0065]實施例3標(biāo)準(zhǔn)品校正效果評價
[0066]取試劑盒中凍干的標(biāo)準(zhǔn)品I管，加入25 μ L蛋白溶解液Α，振蕩溶解后加入25 μ L蛋白溶解液B，混勻。用移液器取I UL標(biāo)準(zhǔn)品液，點于質(zhì)譜樣品靶板上，室溫干燥后在蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上覆蓋I μ L用基質(zhì)溶解液制備的α -氫基-4-羥基肉桂酸飽和溶液，室溫干燥后進(jìn)質(zhì)譜。
[0067](I)AXIMA 系統(tǒng)
[0068]采用島津公司Launchpad采集軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。質(zhì)譜參數(shù)設(shè)定:線性陽離子模式；采集的質(zhì)荷比范圍為2，000-20，OOODa ;激光頻率，50.0Hz ;延時提取，200ns ;每個樣本最少5個shots形成一張譜圖。島津公司標(biāo)準(zhǔn)的校正方法為直接涂抹新鮮培養(yǎng)的大腸桿菌ATCC8739菌落。由于基質(zhì)α-氫基-4