一種神經生長因子制劑中神經生長因子含量的測定方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種神經生長因子制劑中神經生長因子含量的測定方法，尤其涉及一 種使用超高效液相色譜法中的凝膠色譜法測定神經生長因子制劑中神經生長因子含量的 方法。
【背景技術】
[0002] 神經生長因子（NGF)是神經系統(tǒng)最主要的活性成分之一，它能維持交感神經和感 覺神經細胞的生存，具有神經元營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學功能，對中樞及周圍神經元 的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調控作用，對保護神經系統(tǒng)的正 常功能具有重要作用。
[0003]目前，國內生產、銷售的各種NGF制劑均為凍干粉針劑型，并使用人血清白蛋白作 為穩(wěn)定劑，而一些攜帶來源于供血者血液中不易檢測的病毒的人血清白蛋白會給生產的制 劑帶來污染，在患者用藥的同時導致嚴重的傳染性疾病，鑒于此種問題時有發(fā)生，已經開發(fā) 出使用氨基酸的混合物作為穩(wěn)定劑，替代人血清白蛋白，有效避免了人血清白蛋白導致的 血液制品污染，并且降低了生產成本。
[0004] 同時，含有使用人血清白蛋白作為穩(wěn)定劑的NGF制劑，由于制劑中NGF的含量較 低，而人血清白蛋白與NGF均為蛋白質，且在制劑中的濃度明顯高于NGF，因而嚴重影響了 NGF的準確定量。目前常用于生物制品中蛋白質含量測定的方法如Lowry法、紫外吸收法、 Bradford法、酶聯(lián)免疫吸附（ELISA)、SDS-PAGE法等均不能有效排除這種干擾，而且無法準 確定量。公開號為CN1566941的專利中公開了一種測定制劑中神經生長因子含量的方法， 該方法在檢定時，雖然能夠較準確地測定制劑中NGF的含量，但是該方法仍難以使NGF與白 蛋白達到完全分離，也難以準確測定出有效成分NGF的含量，不利于產品質量控制。
[0005] 有鑒于此，需要一種能夠有效測定制劑中NGF含量的方法。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種可以測定神經生長因子制劑中神經生長因子含量的方 法。
[0007] 除非特別指明，本發(fā)明中的"去白蛋白神經生長因子制劑"指"不含人血白蛋白的 神經生長因子制劑，如含有穩(wěn)定劑為氨基酸的神經生長因子制劑。
[0008] 本發(fā)明的神經生長因子制劑中神經生長因子含量的測定方法為使用超高效液相 色譜法中的凝膠色譜法測定神經生長因子含量，所述凝膠色譜法的色譜條件為：
[0009] 凝膠色譜柱為分子量檢測范圍為1000~80000道爾頓、孔徑為125-200埃的UPLC 分子篩色譜柱；
[0010] 流動相為pH值6. 5~7. 2,濃度為0. 1~0. 5M的磷酸鹽緩沖液，所述流動相中有 機相的含量為5~20體積％，所述有機相為乙腈、甲醇或異丙醇，優(yōu)選為乙腈；所述流動相 中有機相的含量優(yōu)選為15體積％ ;
[0011] 柱溫為 30 ~50°C;
[0012] 所述流動相的流速為0? 1~0? 5ml/min，所述流速優(yōu)選為0? 1~0? 3ml/min ;
[0013] 該檢測器采用鈦流通池，檢測波長為205~280nm ;優(yōu)選地，所述檢測波長為 205~220nm ;所述檢測器優(yōu)選為紫外檢測器。
[0014] 在本發(fā)明的較佳實施方案中，所述流速為0. 2ml/min。
[0015] 在本發(fā)明的較佳實施方案中，所述凝膠色譜柱選自Waters UPLC SEC，1.7 iim， 4. 6 X 150mm，該色譜柱的分子量范圍在1000~80000道爾頓、孔徑為125埃。
[0016] 在本發(fā)明的較佳實施方案中，流動相pH值為7.0,柱溫為40°C。
[0017] 在本發(fā)明的較佳實施方案中，檢測波長為214nm。
[0018] 在本發(fā)明的較佳實施方案中，凝膠色譜法的進樣量為2 ill。
[0019] 在本發(fā)明的較佳實施方案中，所述制劑包括含人血白蛋白的神經生長因子制劑和 去白蛋白神經生長因子制劑。
[0020] 在本發(fā)明的較佳實施方案中，所述神經生長因子的含量通過外標法測定。
[0021] 本發(fā)明相比較之前的測定方法，能夠將NGF與輔料完全分開；并且檢測時間縮短 了 4倍，溶劑使用量減小了 3倍，樣品量減小了 10倍，適合于獲得量較少的樣品測定；同 時，采用機器自動調整配比，進行pH值的調節(jié)，自動化程度高，減少了人為誤差；最重要的 是，有效排除了制劑中包含人血白蛋白在內的輔料的干擾，經過方法學驗證，回收率均在 95 %~105 %之間，回收率合格，而且重復性良好，可以對制劑中的NGF進行準確定量。
【附圖說明】
[0022] 圖1表示流動相專屬性圖譜，
[0023] 圖2表示NGF對照專屬性圖譜，
[0024] 圖3表示含人血白蛋白NGF制劑空白輔料專屬性圖譜，
[0025] 圖4表示含人血白蛋白NGF制劑專屬性圖譜，
[0026] 圖5表示去白蛋白NGF制劑樣品空白輔料專屬性圖譜，
[0027] 圖6表示去白蛋白NGF制劑樣品專屬性圖譜，
[0028] 圖7表示流速為0. lml/min的含人血白蛋白NGF制劑樣品圖譜，
[0029] 圖8表不流速為0. lml/min時測定的去白蛋白神經生長因子制劑樣品圖譜，
[0030] 圖9表示流速為0. 5ml/min時測定的含人血白蛋白NGF制劑樣品圖譜，
[0031] 圖10表示流速為0. 5ml/min時測定的去白蛋白NGF制劑樣品圖譜，
[0032] 圖11表示采用普通流通池測定的含人血白蛋白NGF制劑樣品圖譜，
[0033] 圖12表示采用普通流通池測定的去白蛋白NGF制劑樣品圖譜。
[0034] 圖13表示甲醇：0? 1M PBS = 20:80, pH = 6. 5為流動相、柱溫為50°C時測定的含 人血白蛋白NGF制劑樣品圖譜。
[0035] 圖14表示異丙醇：0? 5M PBS = 5:95，pH = 7. 2為流動相、柱溫為30°C時測定的含 人血白蛋白NGF制劑樣品圖譜。
[0036] 圖15表示檢測波長為205nm時測定的含人血白蛋白NGF制劑樣品圖譜。
[0037] 圖16表示檢測波長為214nm時測定的含人血白蛋白NGF制劑樣品圖譜。
[0038] 圖17表示檢測波長為220nm時測定的含人血白蛋白NGF制劑樣品圖譜。
[0039] 圖18表示檢測波長為280nm時測定的含人血白蛋白NGF制劑樣品圖譜。
【具體實施方式】
[0040] 由于現有方法均不能有效排除這種干擾，難以將NGF與人血白蛋白達到完全分 離，也難以準確測定出有效成分NGF的含量，不利于產品質量控制。因此，本發(fā)明的發(fā)明人 開發(fā)了 UPLC凝膠色譜法，并驚奇地發(fā)現通過使用鈦流通池，能夠將NGF和輔料完全分開， 有效排除人血白蛋白的干擾，從而達到了準確測定NGF含量的目的；并且現有方法中每個 樣品的走樣時間需要約20分鐘，而UPLC-SEC可以在5分鐘內實現完全分離，大大節(jié)約了時 間，節(jié)省了溶劑使用量。
[0041] 本發(fā)明的神經生長因子制劑中神經生長因子含量的測定方法為使用超高效液相 色譜法中的凝膠色譜法測定神經生長因子，色譜條件為 ：
[0042] (1)凝膠色譜柱：分子量檢測范圍為1000~80000道爾頓、孔徑為125-200埃的 UPLC分子篩色譜柱；
[0043] (2)流動相：pH值為6. 5~7. 2,濃度為0? 1~0? 5M的磷酸鹽緩沖液，含5~20體 積％有機相，所述有機相為乙腈、甲醇或異丙醇，含有該有機相的流動相能夠保證峰形好， 優(yōu)選地當使用乙腈時，還能保證壓力低。
[0044] (3)柱溫：40°C;流速：0? 1~0? 5ml/min;檢測波長：205~280nm;檢測器：采用鈦 流通池；流速優(yōu)選為0. 1~0. 3ml/min，更優(yōu)選地為0. 2ml/min，該流速下能夠使NGF和輔料 完全分離，從而更準確地測定制劑中NGF的含量。檢測波長優(yōu)選為205~220nm，更優(yōu)選地 214nm，該波長經方法耐用性驗證，在檢測波長214 ± 5nm范圍內進行NGF含量檢測時，對NGF 含量測定值無影響。
[0045] 所述凝膠色譜柱選自Waters UPLC SEC,1. 7 y m，4.6 X 150mm，該色譜柱的分子量 范圍在1000~80000道爾頓、孔徑為125埃。
[0046] 通過實驗，獲得本發(fā)明的較佳實施方案，其中流動相pH值為7. 0,流速為0. 2ml/ min，檢測波長為214nm，進樣量為1。
[0047] 使用超高效液相色譜法中的凝膠色譜法對制劑中NGF含量進行測定，其基本原理 是通過流經色譜柱的各種物質的分子量差異將其分離，分子量越大，保留時間越短。由于每 種物質在一定條件下具有特定的保留時間，因此可通過色譜圖上的保留時間獲知目的峰的 位置和相關參數，并通過峰面積