。
[0024]4)加入Sybr Green I熒光染料，它能與雙鏈DNA特異性結(jié)合，在495 nm光激發(fā)下，在525 nm處有很強(qiáng)的熒光。熒光強(qiáng)度與Hg2+濃度具有相關(guān)性，從而可達(dá)到檢測Hg 2+的目的。如果沒有Hg2+存在，DNA2無法捕獲在磁珠上，從而DNA3和DNA4無法在磁珠上組裝，磁珠分離后，體系熒光很弱，只有背景熒光。
[0025]實(shí)施例2
基于核酸探針首尾互補(bǔ)策略用于汞離子的檢測方法，按照如下步驟進(jìn)行:
(I)將I mM生物素修飾的DNAl加入到鏈霉親和素修飾的磁珠溶液中，充分混勻，室溫反應(yīng)30分鐘，磁珠分離，去除多余的DNA1。
[0026](2)磁珠-DNAl混合物用20 mMTris-醋酸緩沖液(pH 7.5，含有50 mM醋酸鈉)重懸，然后加入I mM的DNA2，以及Hg2+，充分混勻，室溫反應(yīng)30分鐘，磁珠分離，去除多余的DNA2o
[0027](3)上述混合物再次用20 mMTris-醋酸緩沖液(pH 7.5，含有50 mM醋酸鈉)重懸，再加入2mM DNA3和2mM DNA4，室溫反應(yīng)60分鐘，磁珠分離，去除多余的DNA3和DNA4。
[0028](4)上述混合物再次用20 mMTris-醋酸緩沖液(pH 7.5，含有50 mM醋酸鈉)重懸，再加入Sybr Green I溶液，在495 nm光源激發(fā)下，測525 nm處的熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度與Hg2+濃度具有相關(guān)性。
[0029]實(shí)施例3
對不同濃度Hg2+的檢測:
配制Hg2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為ΙΟρΜ、100 pM、I nM、10 nM、100 nM和500 nM，室溫保存。
[0030]將不同濃度的Hg2+溶液分別加到實(shí)施例1中所述的反應(yīng)體系中，充分反應(yīng)后檢測熒光強(qiáng)度，如圖2所示，隨著Hg2+濃度的增加，對應(yīng)的熒光強(qiáng)度也增加，當(dāng)Hg2+濃度超過100nM時(shí)，逐漸達(dá)到飽和。以Hg2+濃度的對數(shù)(Ig )為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，二者具有很好的線性關(guān)系，線性范圍是從1pM到100 nM，線性方程是..F = 191.8IgC+ 18.4 (R=0.989)，按照3倍信噪比標(biāo)準(zhǔn)(3S/N)，檢測限為2 pM。
[0031]實(shí)施例4
特異性實(shí)驗(yàn):
配制濃度為100 nM的不同干擾物標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別是Cu2+、Pb2+、Fe3+、Mn2+、Cr3+、Co2+、Cd2+和 Zn2+。
[0032]將100 nM的不同干擾物標(biāo)準(zhǔn)溶液和10pM Hg2+標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加到實(shí)施例1中所述的反應(yīng)體系中，充分反應(yīng)后檢測熒光強(qiáng)度，如圖3所示，100 nM的Cu2+、Pb2+、Fe3+、Mn2+、Cr3+、Co2+、Cd2+和Zn 2+的熒光強(qiáng)度很弱，對檢測不產(chǎn)生影響。只有當(dāng)加入Hg 2+才會使熒光強(qiáng)度明顯增加，這證明該方法對Hg2+的檢測具有很好的特異性。
[0033]以上實(shí)施例僅為介紹本發(fā)明的優(yōu)選案例，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不背離本發(fā)明精神的范圍內(nèi)所進(jìn)行的任何顯而易見的變化和改進(jìn)，都應(yīng)被視為本發(fā)明的一部分。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種汞離子的檢測試劑盒，其包括: (O分離介質(zhì) (2)DNAl，所述DNAl固定在分離介質(zhì)上，其至少含有3個(gè)T堿基； (3)DNA2，在Hg2+存在的情況下，DNA2中至少有3個(gè)T堿基與DNAl中的3個(gè)T堿基形成T-Hg2+-T復(fù)合物，從而把DNA2捕獲在分離介質(zhì)上； (4)DNA3和DNA4，DNA3的5’端與DNA4的5’端互補(bǔ)，DNA3的3’端與DNA4的3’端互補(bǔ)，DNA3的3’端與DNA2的3’端互補(bǔ)； (5)Sybr Green I 熒光染料。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的汞離子的檢測試劑盒，其特征在于，所述DNA3的3’端至少有8個(gè)堿基與DNA4的5’端互補(bǔ)；DNA3的5’端至少有8個(gè)堿基與DNA4的3’端互補(bǔ)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的汞離子的檢測試劑盒，其特征在于，DNA3的3’端至少有8個(gè)堿基與DNA2的3’端互補(bǔ)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的汞離子的檢測試劑盒，其特征在于: (1)DNAl的序列如下:5’-CAGTTTGGTTTTCTCTTGC-3’ ； (2)DNA2的序列如下:5’-GCTTGAGATTTTCCATTCTGACTACTAGGGTCTGAGGG-3’ ； (3)DNA3的序列如下所示:5’-TACTCCCCCAGGTGCCCCTCAGACCCTAGTAGT-3 ； (4)DNA4的序列如下所示:5’-GCACCTGGGGGAGTAACTACTAGGGTCTGAGGG-3’ 。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的汞離子的檢測試劑盒，其特征在于，所述分離介質(zhì)包括磁珠、金納米顆粒中的任一種；所述磁珠與DNAl通過鏈霉親和素-生物素連接；所述金納米與DNAl通過巰基連接。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的汞離子的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括PH7.5的Tris-醋酸緩沖液。7.一種汞離子的檢測方法，包括如下步驟: (1)將DNAl固定在分離介質(zhì)上，然后分散于緩沖溶液中； (2)加入DNA2和待檢樣品，混勻，分離分離介質(zhì)，去除多余的DNA2； (3)加入DNA3和DNA4，混勻，分離分離介質(zhì)，去除多余的DAN3和DNA4； (4)加入SybrGreen I焚光染料，混勾，檢測焚光強(qiáng)度，根據(jù)事先建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待檢樣品中汞離子的濃度； 其中，DNAl?DNA4的序列組成如權(quán)利要求1_4任一項(xiàng)所示。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的汞離子的檢測方法，其特征在于，所述分離介質(zhì)包括磁珠、金納米顆粒中的任一種；所述磁珠與DNAl通過鏈霉親和素-生物素連接；所述金納米與DNAl通過巰基連接。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的汞離子的檢測方法，其特征在于，所示緩沖液為pH7.5的Tris-醋酸緩沖液。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的汞離子的檢測方法，其特征在于，步驟(4)是在495nm光源 激發(fā)下，測525 nm處的熒光強(qiáng)度。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于核酸探針首尾互補(bǔ)策略的汞離子的檢測方法及檢測試劑盒。設(shè)計(jì)富含T堿基的核酸為分子識別元件，通過T-Hg2+-T配對，與捕獲探針結(jié)合，從而固定在磁珠上，磁珠分離后加入首尾互補(bǔ)的兩條核酸探針，通過不斷雜交互補(bǔ)，從而形成很長的雙鏈DNA，磁珠分離后加入熒光嵌入劑Sybr Green I，它與雙鏈DNA結(jié)合后具有很強(qiáng)的熒光特性，熒光強(qiáng)度與汞離子濃度具有很好的相關(guān)性，從而達(dá)到檢測汞離子的目的。本發(fā)明的檢測方法及檢測試劑盒具有較高的靈敏度，對Hg2+的檢測限為2pM，具有很好的特異性，常見的其他干擾離子對檢測不產(chǎn)生影響。信號放大過程源于DNA探針的首尾不斷互補(bǔ)，無需使用蛋白酶，操作簡單，成本低廉。
【IPC分類】G01N21/64
【公開號】CN104977280
【申請?zhí)枴緾N201510282593
【發(fā)明人】陳俊華, 周順桂
【申請人】廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2015年5月28日