一種用于檢測(cè)大田軟海綿酸的生物傳感器及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測(cè)貝類毒素大田軟海綿酸的生物傳感器及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大田軟海綿酸(okadaic acid，0A)，一種小分子海洋聚醚類毒素，是分布最廣、發(fā)病率最高的海洋毒素之一，常蓄積于貝類等海洋生物體內(nèi)，可經(jīng)食物鏈引發(fā)多種以腹瀉為主要特征的食物中毒，能導(dǎo)致嚴(yán)重的胃腸功能紊亂，中毒癥狀極易與細(xì)菌性胃腸炎混淆。大田軟海綿酸中毒后無(wú)特效藥救治，沿海地區(qū)時(shí)有誤食腹瀉性貝類毒素污染的貽貝等而引發(fā)中毒，嚴(yán)重影響了人們的身體健康和海產(chǎn)品的開發(fā)利用。因此，建立快速、靈敏和可靠的大田軟海綿酸的檢測(cè)方法以及檢測(cè)設(shè)備對(duì)保障海產(chǎn)品安全尤為重要。
[0003]目前大田軟海綿酸的生物檢測(cè)方法中常用的有小鼠生物法和酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法(ELISA)等，其中小鼠生物法比較直觀，可直接判斷該樣品是否可供使用，但檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度低、個(gè)體差異大，不能確定毒素的組成成分，定量困難，假陽(yáng)性率高、重現(xiàn)性差。ELISA法具有較高的敏感度，但ELISA法中抗體往往只針對(duì)主要成分，其類似物可能會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng)，從而出現(xiàn)假陽(yáng)性或?qū)Χ拘缘墓烙?jì)不準(zhǔn)確，而且單克隆抗體的制備困難，試劑盒價(jià)格昂貴，我國(guó)目前尚沒有商品化ELISA試劑盒可售。
[0004]申請(qǐng)?zhí)枮閆L201010266834.9 (授權(quán)公告號(hào)為CN101975768B)的中國(guó)發(fā)明專利《腹瀉性貝類毒素檢測(cè)方法》中公開了一種檢測(cè)大田軟海綿酸的方法，該方法通過建立大田軟海綿誘導(dǎo)HL-7702肝細(xì)胞F-肌動(dòng)蛋白(F-actin)解聚的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)HL-7702肝細(xì)胞F-actin解聚的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行OA濃度的計(jì)算，建立腹瀉性貝類毒素的細(xì)胞F-actin檢測(cè)方法，確定可能的檢出限范圍，同時(shí)選擇與腹瀉性貝類毒素可能共存的成分STX、DA、YTX中的一種或幾種作用HL-7702肝細(xì)胞，通過檢測(cè)其破壞HL-7702肝細(xì)胞F-actin聚合能力的大小確定該方法測(cè)定OA含量的特異性。該方法與小鼠生物法相比具有符合3R原則、靈敏度高、特異性較好、重復(fù)性好以及樣品提取簡(jiǎn)便，基質(zhì)效應(yīng)低等優(yōu)點(diǎn)；與ELISA法相比具有特異性較好，靈敏度更高的優(yōu)點(diǎn)，但該方法中以細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，培養(yǎng)周期和成本較高，且檢測(cè)結(jié)果不直觀，不適應(yīng)快速檢測(cè)的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種特異性高、檢測(cè)周期短以及成本低的用于檢測(cè)大田軟海綿酸的生物傳感器。
[0006]本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種上述生物傳感器的制備方法。
[0007]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種用于檢測(cè)大田軟海綿酸的生物傳感器，包括絕緣性基體、形成在該基體上的含有工作電極、參比電極和對(duì)電極的電極系統(tǒng)，其特征在于，所述工作電極上固定有生物酶層，該生物酶層包括蛋白磷酸酶2A(PP2A酶)以及電子傳遞體。
[0008]所述電子傳遞體為對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽，對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽在PP2A作用下產(chǎn)生對(duì)硝基苯和磷酸鹽離子，對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽的去磷酸化反應(yīng)可以電化學(xué)信號(hào)記錄。
[0009]作為優(yōu)選，所述參比電極為Ag/AgCl電極，對(duì)電極為石墨電極，Ag/AgCl電極是重現(xiàn)性和穩(wěn)定性最好的參比電極之一，對(duì)電極在三電極系統(tǒng)中僅起到與工作電極形成回路，以使電極系統(tǒng)中電流通過的作用，因此選擇較穩(wěn)定的石墨作為對(duì)電極。
[0010]上述技術(shù)方案中用于檢測(cè)大田軟海綿酸的生物傳感器的制備方法中所述PP2A酶通過光交聯(lián)法或瓊脂糖包埋法固定在所述工作電極上。
[0011]所述光交聯(lián)法的具體步驟為:
[0012](I)將PP2A酶溶解在pH8?8.7的緩沖液A中制成I?2個(gè)單位/ul的酶溶液，在該酶溶液中加入PVA-AWP，所述PP2A酶與所述PVA-AWP的質(zhì)量比為I?2:1，均質(zhì)后形成固定溶液，所述緩沖液A包含Tris - HC1.EDTA以及MgCl2，所述I單位PP2A酶為在25°C下Imin內(nèi)裂解所述對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽所需的酶量；
[0013](2)然后滴加2.5?3.5ul所述固定溶液(包含1_3個(gè)單位的PP2A酶)至工作電極表面，3?5°C下在功率為12?15W的日光燈下照射3?6h ;
[0014](3)光照后，3?5°C下干燥12?24h，干燥后用雙蒸水沖洗，以去除物理吸附的多余的PP2A酶，將制得的固定化PP2A酶電極在4 °C下保存?zhèn)溆谩?br>[0015]作為優(yōu)選，上述緩沖液A包含30mM Tris - HCl、2mM EDTA和20mM MgCl2, pH值為8.4。
[0016]所述瓊脂糖包埋法的具體步驟為:
[0017](I)將0.1?0.2g瓊脂糖加入到50?100ml pH為8?8.7的Tris - HCl緩沖液中，55?65°C加熱4?6min，充分溶解后得瓊脂糖溶液，待該瓊脂糖溶液降溫至20?27°C時(shí)，將PP2A酶加入到瓊脂糖溶液中并充分混合形成混合液，該混合液中PP2A酶的濃度為I?2個(gè)單位PP2A酶/ul，其中所述I單位PP2A酶為在25°C下Imin內(nèi)裂解所述對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽所需的酶量；
[0018](2)上述混合液3?5°C放置11?13h后，取2.5?3.5ul滴涂于所述工作電極表面，室溫下干燥成膜5?6h ;
[0019](3)干燥后用雙蒸水沖洗，以去除物理吸附的多余的PP2A酶，將制得的固定化PP2A酶電極在4 °C下保存?zhèn)溆谩?br>[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明利用大田軟海綿酸對(duì)PP2A酶活力的抑制作用制成以PP2A酶為固定化酶層的生物傳感器，通過PP2A酶活性抑制的程度測(cè)定樣品中大田軟海綿酸含量的高低，即將樣品中大田軟海綿酸濃度轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果更加直觀，同時(shí)利用PP2A酶促反應(yīng)的專一性和高效性，使得檢測(cè)過程特異性高，檢測(cè)結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確率高，同時(shí)檢測(cè)周期短，可實(shí)現(xiàn)即時(shí)、快速檢測(cè)的需要，本發(fā)明用于檢測(cè)水產(chǎn)品大田軟海綿酸時(shí)，檢出限低于1.00μ g/L、重現(xiàn)性RSD〈5%，檢測(cè)耗時(shí)小于0.5h。
【附圖說明】
[0021]圖1為本發(fā)明中用于檢測(cè)大田軟海綿酸的生物傳感器的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0022]圖2為本發(fā)明中用于檢測(cè)大田軟海綿酸的生物傳感器的原理示意圖；
[0023]圖3為本發(fā)明中不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液中大田軟海綿酸對(duì)PP2A酶活性的抑制率(％)。
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0025]如圖1所示，一種用于檢測(cè)大田軟海綿酸的生物傳感器，包括PVC膜基體1，該基體I上絲網(wǎng)印刷有含工作電極2、參比電極3和對(duì)電極4的三電極系統(tǒng)，且工作電極2、參比電極3和對(duì)電極4分別通過傳導(dǎo)帶5與基體I外的傳導(dǎo)終端6連接。工作電極2近似圓形以方便樣品的滴加，參考電極3和對(duì)電極4呈圓弧狀，對(duì)稱設(shè)置在工作電極2的兩側(cè)，工作電極2上固定有生物酶層21,該生物酶層21包括蛋白磷酸酶2A(PP2A)(Upstate B1technology,美國(guó))以及電子傳遞體。如圖2所示，對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽在PP2A酶作為下分解為對(duì)硝基苯酚和磷酸鹽離子，大田軟海綿酸是PP2A酶的烈性抑制劑，能抑制蛋白磷酸酶活性而導(dǎo)致蛋白質(zhì)過磷酸化，本發(fā)明利用大田軟海綿酸對(duì)PP2A酶活力抑制的這一特性，選用硝基苯磷酸二鈉鹽(西格瑪奧德里奇公司，美國(guó))作為電子傳遞體，Ag/AgCl電極作為參比電極，石墨電極作為對(duì)電極，從而構(gòu)成用于檢測(cè)大田軟海綿酸的生物傳感器。
[0026]以下通過實(shí)施例1-1、1_2、1-3、2-1、2-2和2-3來具體闡述上述生物傳感器的制備方法:
[0027]實(shí)施例1-1:
[0028]清洗表面具有工作電極、參比電極和對(duì)電極的PVC膜基體(西格瑪奧德里奇公司，美國(guó))，烘干備用。將PP2A酶溶解在pH為8.4包含30mM Tris-HCl, 2mM EDTA和20mMMgC12的緩沖液A中，制成I個(gè)單位/ul的酶溶液，其中I單位PP2A酶為在25°C下Imin內(nèi)裂解所述對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽所需的酶量。在該酶溶液中加入PVA-AWP (聚乙烯醇-具有疊氮化物單兀側(cè)基的(azide-unit pendant)水溶性光聚合物，Toyo Gosey Kogyo corporat1n,日本)，PP2A酶與PVA-AWP的質(zhì)量比為2:1，均質(zhì)后形成固定溶液。然后滴加3ul固定溶液至工作電極表面，4°C下在功率為15