對(duì)過氧化氫和多酚類化合物高靈敏度檢測(cè)的生物傳感器、制備及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生物傳感器、制備及其應(yīng)用，特別是 一種對(duì)過氧化氨和多酷類化合物高靈敏度檢測(cè)的生物傳感器、制備及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 撲晰及其衍生化合物廣泛存在于生物體內(nèi)和能量轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要細(xì)胞器內(nèi)。鐵口h 晰化emin)是血紅蛋白的活性中也，在運(yùn)輸氧的過程中起重要作用。血色素與鐵撲晰結(jié)構(gòu) 類似，H價(jià)鐵離子為其活性中也，血色素對(duì)氮?dú)狻⒀鯕狻⒁谎趸?、二氧化碳和過氧化物等有 極高的催化性能，其催化活性是由與撲晰環(huán)配位的H價(jià)鐵離子在得失電子過程中提供。但 是，由于缺乏適宜的仿生環(huán)境，其電子傳遞效率大大低于天然酶，因此為了實(shí)現(xiàn)其在電極表 面可逆的直接電子轉(zhuǎn)移，選擇合適的電極修飾材料和固定方法就顯得非常重要。
[0003]目前研究較多的是石墨帰和碳納米管等，由于石墨帰和碳納米管的量子尺寸效應(yīng) 和大的共輛表面，使得其在促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移方面有著不可或缺的作用，石墨帰和碳納米管的 使用為血色素的高效仿生催化提供了可能。數(shù)年來，研究者一直致力于如何更好地將血色 素穩(wěn)定的固定于石墨帰或碳納米管上。郭通過將血色素連接到石墨帰納米片上，使石墨 帰納米片功能化，之后將功能化石墨帰修飾于玻碳電極上，該種將石墨帰納米片功能化的 方法制備過程復(fù)雜，不易操作且納米片大小不易控制，所W重復(fù)性不高[SensActuators B，2011，160:295-300]。韋使用的是用還原性氧化石墨帰固定血色素，該種方法雖制備相對(duì) 簡(jiǎn)單，但是檢測(cè)靈敏度不高[Nanotechnol，2012, 23:335707-335714]。屠采用的是碳納米管 與血色素之間的協(xié)同作用，將血色素固定于碳納米管上，該種協(xié)同作用不穩(wěn)定，且固定的血 色素的量不易控制[Acid.ChemEurJ，2009, 15:779-784]。2001年，陳成功的利用1-巧下 酸將蛋白質(zhì)固定于碳納米管上，之后1-巧下酸作為一種新型的生物分子與碳材料之間的 連接劑被廣泛關(guān)注[J.Am.化em.Soc. 2001，123, 3838-3839]。1-巧下酸包含四個(gè)苯環(huán)，可W 與碳納米管和石墨帰通過n-Ji堆積作用穩(wěn)定結(jié)合，所W，l-巧下酸可W作為連接蛋白質(zhì) 和其他生物分子到碳材料上的一種手段。然而無論是石墨帰還是碳納米管，它們的前期處 理均較復(fù)雜且當(dāng)其修飾到電極上時(shí)不易穩(wěn)定，所W我們一直致力于研究一種制備過程簡(jiǎn)單 且性能穩(wěn)定的仿生傳感器，
[0004]聚3, 4-己撐二氧喔吩-聚（苯己帰賴酸牌D0T-PSS)，自20世紀(jì)80年代合成后， 已被作為一種穩(wěn)定的共價(jià)聚合物廣泛使用，P邸0T電子傳遞速率高且極易成膜。研究表明， 陽DOT作為修飾電極材料對(duì)酷類化合物，多己胺，尿酸和嗎啡等有良好的電催化性能。另外， 陽D0T-PSS含有大n鍵的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可W通過n-n共輛作用有力的連接含有苯環(huán)的化合 物，該樣可同時(shí)發(fā)揮P邸0T促進(jìn)電子傳遞的優(yōu)良特性，但是目前通過P邸0T的n-ji共輛作 用制備仿生傳感器還尚未發(fā)現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)傳感器制備過程復(fù)雜，且靈敏度不高等缺陷，我們的目的在于提供 一種生物傳感器、制備及其應(yīng)用。
[0006] 發(fā)明原理；通過對(duì)1-巧下酸連接蛋白質(zhì)到碳納米管上的理論研究發(fā)現(xiàn)1-巧下酸 與碳納米管之間存在n-n共輛作用，該種連接作用力穩(wěn)定，且可同時(shí)發(fā)揮碳納米管的優(yōu) 勢(shì)，然而碳納米管前期處理較復(fù)雜且當(dāng)其修飾到電極上時(shí)不穩(wěn)定，為了研發(fā)出制備過程簡(jiǎn) 單且性能穩(wěn)定的仿生傳感器，我們探索到一種與碳納米管類似的可通過n-n共輛作用連 接1-巧下酸的聚合物：聚3, 4-己撐二氧喔吩-聚（苯己帰賴酸（P邸0T-PSS)，陽D0T-PSS 性能穩(wěn)定，電子傳遞速率高且極易成膜，制備過程簡(jiǎn)單。本發(fā)明第一次采用P邸0T作為電極 修飾材料連接1-巧下酸，在極性有機(jī)溶劑DMF中，1-巧下酸可W不可逆地吸附到聚3, 4-己 撐二氧喔吩（P邸0T)膜的疏水表面?；赪上考慮，我們首次利用n-Ji共輛效應(yīng)，將1-巧 下酸與導(dǎo)電高聚物P邸0T相連，同時(shí)，利用ZrOCls可與駿基形成駿基-Zr4+-駿基配位鍵的 性質(zhì)，將血色素固定于1-巧下酸上。
[0007] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的該些問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種對(duì)過氧化氨和多酷 類化合物高靈敏度檢測(cè)的生物傳感器，所述生物傳感器是W血色素為主體、P邸0T為修飾材 料、1-巧下酸為中間連接劑，將P邸0T與1-巧下酸通過n-ji共輛作用連接，1-巧下酸與 血色素通過鉛離子的配位化學(xué)作用形成的仿生傳感器，其結(jié)構(gòu)如下：
[0008]
[0009] A:P邸OT;B;血色素；C;1-巧下酸
[0010] 一種對(duì)過氧化氨和多酷類化合物高靈敏度檢測(cè)的生物傳感器的制備：包括W下步 驟：
[0011] 步驟一、玻碳電極拋光；
[0012] 步驟二、通過循環(huán)伏安法將3, 4-己撐二氧喔吩（ED0T)聚合于玻碳電極上；
[0013] 步驟H、將聚合完成后的電極取出后用超純水淋洗，氮?dú)獯蹈桑?br>[0014] 步驟四、將前期處理的電極浸泡于1-巧了酸溶液中，溶劑為N，N-二甲基甲醜胺 (DMF)，然后分別在DMF和超純水中震蕩去除多余的1-巧下酸和DMF溶液，之后氮?dú)獯蹈桑?br>[0015] 步驟五、將修飾完1-巧下酸的電極浸泡于氯氧化鉛溶液中，然后用溶劑淋洗電 極，氮?dú)獯蹈桑?br>[0016] 步驟六、將血色素溶于DMF溶劑中，再將血色素溶液滴加到含水的電極表面，2~ 5C的溫度下靜置比，分別用DMF和超純水淋洗，除去多余的血色素和DMF。
[0017] 步驟二中所述的循環(huán)伏安法掃描電位為-0. 2~1. 2V，優(yōu)選-0. 1~1. 0V，掃描速 率為0. 05~0. 15V/S，優(yōu)選0.IV/s，所述的聚合圈數(shù)為6~10圈，優(yōu)選8圈。
[0018] 步驟四中所述的1-巧了酸溶液的濃度為0. 5~1. 5mg/ml，優(yōu)選1.Omg/ml，浸泡時(shí) 間1~化，優(yōu)選化。
[0019] 步驟五中所述的氯氧化鉛溶液濃度為0. 5~1. 5mg/ml，優(yōu)選1.Omg/ml，浸泡時(shí)間 為 20 ~50min，優(yōu)選 30min。
[0020] 步驟六中所述的滴加于電極表面的血色素濃度為0. 05~0. 15mmol/L，優(yōu)選 0.Immol/L，電極表面的水與血色素的體積比為1:1，靜置時(shí)間為30~lOOmin，優(yōu)選60min。
[0021] 一種對(duì)過氧化氨和多酷類化合物高靈敏度檢測(cè)的生物傳感器的應(yīng)用，將上述結(jié)構(gòu) 的生物傳感器應(yīng)用于檢測(cè)過氧化氨和多酷類化合物中。
[0022] 本發(fā)明的有益效果為：
[0023] 1、聚3,4-己撐二氧喔吩（P邸0T)為導(dǎo)電高分子，可極大的促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移，從而提 高傳感器的檢測(cè)靈敏度。
[0024] 2、P邸0T性能穩(wěn)定且及易成模，采用它制備電極，工藝簡(jiǎn)單。
[0025] 3、1-巧了酸與陽DOT通過n-ji共輛作用連接，JI-JI共輛作用力很強(qiáng)，可將1-巧 下酸穩(wěn)定的連接到陽DOT上。
[0026] 4、通過鉛離子與駿基形成的配位作用，將血色素連接到1-巧下酸上，該種鉛離子 配位作用極易形成，可在同等面積的電極表面結(jié)合更多的血色素。
[0027] 5、整個(gè)仿生傳感器制備主要采用聚合和浸泡的方法，該種方式操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性 好。
[0028]6、通過兩種特殊的化學(xué)鍵連接血色素制成的傳感器，穩(wěn)定性好，可重復(fù)使用，且制 備簡(jiǎn)單。
【附圖說明】
[0029] 圖1是本發(fā)明中裸玻碳電極和實(shí)施例3、6、9中的修飾電極在50mmol/ L[Fe(CN)e]-s/-4 (1:1)的0.Imol/L的KN03溶液中的電化學(xué)交流阻抗圖。
[0030] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例9的修飾電極對(duì)鄰苯二酷的時(shí)間電流曲線和濃度與電流的線 性關(guān)系圖。
[0031] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例9的修飾電極對(duì)過氧化氨的時(shí)間電流曲線和濃度與電流的線 性關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 本實(shí)驗(yàn)采用導(dǎo)電聚合物陽DOT和1-巧下酸制備的化matin仿生傳感器，制備過程 簡(jiǎn)單，穩(wěn)定。且通過實(shí)驗(yàn)證明，該種仿生傳感器對(duì)鄰苯二酷和過氧化氨均有極好的催化效果 和較高的檢測(cè)靈敏度，進(jìn)一步說明此項(xiàng)發(fā)明的可行性。
[0033] 實(shí)施例1;采用直徑3mm的玻碳電極，將電極在0. 05ym的氧化鉛息浮液中打磨 至鏡面，然后分別在己醇和水中超聲2min，氮?dú)獯蹈珊?，將電極置于含有l(wèi)Ommol/L的邸0T 和0. 3mg/ml的PSS水溶液中，米用循環(huán)伏安法聚合邸0T于電極上，循環(huán)伏安法掃描電位 為-0. 2~0. 8V，掃描速率0. 05V/S，所述的聚合圈數(shù)為6圈。
[0034]實(shí)施例2;同實(shí)施例1，電極的前期處理過程不變，只改變循環(huán)伏安法聚合邸0T的 掃描電位，設(shè)置掃描電位為0~1. 2V，掃描速率0. 15V/S，所述的聚合圈數(shù)為10圈。
[003引實(shí)施例3:同實(shí)施例1，電極的前期處理過程不變，P邸0T膜的修飾，只改變循環(huán)伏 安法聚合邸0T的掃描電位，設(shè)置掃描電位為-0. 1~1. 0V，掃描速率0.IV/s，所述的聚合圈 數(shù)為8圈。
[003引實(shí)施例4 ; 1-巧了酸與陽DOT膜31 -JI共輛效應(yīng)的形成，取實(shí)施例3中的修飾電極 浸泡于1-巧了酸溶液中，1-巧了酸的濃度為0. 5mg/ml，浸泡時(shí)間比，然后分別在DMF和超 純水中震蕩去除多余的1-巧下酸和DMF溶液，之后氮?dú)獯蹈桑?br>[0037] 實(shí)施例5 ; 1-巧下酸與陽DOT膜31 -JI共輛效應(yīng)的形成，取實(shí)施例3中的修飾電極 浸泡于1-巧下酸溶液中，1-巧下酸的濃度為1. 5mg/ml，浸泡時(shí)間化，然后分別在DMF和超 純水中震蕩去除多余的1-巧下酸和DMF溶液，之后氮?dú)獯蹈桑?br>[003引實(shí)施例6; 1-巧了酸與陽DOT膜31-JI共輛效應(yīng)的形成，取實(shí)施例3中的修飾電極 浸