一種用于檢測大田軟海綿酸的基于磁性納米粒子修飾的酶傳感器及制備方法
【專利說明】 一種用于檢測大田軟海綿酸的基于磁性納米粒子修飾的酶
傳感器及制備方法
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及分析檢測技術領域，尤其涉及一種用于檢測貝類毒素大田軟海綿酸的基于磁性納米粒子修飾的酶傳感器及制備方法。
【背景技術】
[0002]大田軟海綿酸(okadaic acid，0A)，一種小分子海洋聚醚類毒素，是分布最廣、發(fā)病率最高的海洋毒素之一，常蓄積于貝類等海洋生物體內(nèi)，可經(jīng)食物鏈引發(fā)多種以腹瀉為主要特征的食物中毒，能導致嚴重的胃腸功能紊亂，中毒癥狀極易與細菌性胃腸炎混淆。大田軟海綿酸中毒后無特效藥救治，沿海地區(qū)時有誤食腹瀉性貝類毒素污染的貽貝等而引發(fā)中毒，嚴重影響了人們的身體健康和海產(chǎn)品的開發(fā)利用。因此，建立快速、靈敏和可靠的大田軟海綿酸的檢測方法以及檢測設備對保障海產(chǎn)品安全尤為重要。
[0003]目前大田軟海綿酸的生物檢測方法中常用的有小鼠生物法和酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)等，其中小鼠生物法比較直觀，可直接判斷該樣品是否可供使用，但檢測周期長、靈敏度低、個體差異大，不能確定毒素的組成成分，定量困難，假陽性率高、重現(xiàn)性差。ELISA法具有較高的敏感度，但ELISA法中抗體往往只針對主要成分，其類似物可能會產(chǎn)生交叉反應，從而出現(xiàn)假陽性或?qū)Χ拘缘墓烙嫴粶蚀_，而且單克隆抗體的制備困難，試劑盒價格昂貴，我國目前尚沒有商品化ELISA試劑盒可售。
[0004]申請?zhí)枮閆L201010266834.9 (授權公告號為CN101975768B)的中國發(fā)明專利《腹瀉性貝類毒素檢測方法》中公開了一種檢測大田軟海綿酸的方法，該方法通過建立大田軟海綿誘導HL-7702肝細胞F-肌動蛋白(F-actin)解聚的標準曲線，根據(jù)HL-7702肝細胞F-actin解聚的標準曲線進行OA濃度的計算，建立腹瀉性貝類毒素的細胞F-actin檢測方法，確定可能的檢出限范圍，同時選擇與腹瀉性貝類毒素可能共存的成分STX、DA、YTX中的一種或幾種作用HL-7702肝細胞，通過檢測其破壞HL-7702肝細胞F-actin聚合能力的大小確定該方法測定OA含量的特異性。該方法與小鼠生物法相比具有符合3R原則、靈敏度高、特異性較好、重復性好以及樣品提取簡便，基質(zhì)效應低等優(yōu)點；與ELISA法相比具有特異性較好，靈敏度更高的優(yōu)點，但該方法中以細胞為實驗對象，培養(yǎng)周期和成本較高，且檢測結(jié)果不直觀，不適應快速檢測的需要。
[0005]酶生物傳感器是以固定化酶膜為物質(zhì)識別元件，以基本電極為信號轉(zhuǎn)換器的生物傳感器，當酶膜上發(fā)生酶促反應時，產(chǎn)生的電活性物質(zhì)由基體電極對其響應，基體電極使化學信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，從而對目標物質(zhì)加以檢測。大田軟海綿酸是蛋白磷酸酶2A(Proteinphosphatase2A, PP2A)的烈性抑制劑,能抑制蛋白磷酸酶活性而導致蛋白質(zhì)過磷酸化,利用大田軟海綿酸對PP2A酶活力抑制的這一特性，已經(jīng)發(fā)展和建立了大田軟海綿酸的蛋白磷酸酶活力抑制法，然而，非固定化的PP2A酶穩(wěn)定性不高，且不能實現(xiàn)在線、實時快速檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種準確率高、實時快速的用于檢測大田軟海綿酸的基于磁性納米粒子修飾的酶傳感器。
[0007]本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是提供一種上述基于磁性納米粒子修飾的酶傳感器的制備方法。
[0008]本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為:一種用于檢測大田軟海綿酸的基于磁性納米粒子修飾的酶傳感器，包括絕緣性基體、形成在該基體上的含有工作電極、參比電極和對電極的電極系統(tǒng)，其特征在于，所述工作電極上固定有生物酶層，該生物酶層包括磁性納米粒子修飾的蛋白磷酸酶2A (PP2A)以及電子傳遞體，所述磁性納米粒子的直徑為250nm ?350nmo
[0009]磁性納米粒子可通過多種方式修飾PP2A酶，作為優(yōu)選，所述磁性納米粒子為鎳修飾磁性納米粒子，而所述PP2A酶蛋白質(zhì)鏈氨基末端修飾有能與所述鎳修飾磁性納米粒子共軛鏈接的hexa-His。
[0010]所述電子傳遞體為對硝基苯磷酸二鈉鹽，對硝基苯磷酸二鈉鹽在PP2A作用下產(chǎn)生對硝基苯和磷酸鹽離子，對硝基苯磷酸二鈉鹽的去磷酸化反應可以電化學信號記錄。
[0011]作為優(yōu)選，所述參比電極為Ag/AgCl電極，對電極為石墨電極，Ag/AgCl電極是重現(xiàn)性和穩(wěn)定性最好的參比電極之一，對電極在三電極系統(tǒng)中僅起到與工作電極形成回路，以使電極系統(tǒng)中電流通過的左右，因此選擇較穩(wěn)定的石墨作為對電極。
[0012]上述用于檢測大田軟海綿酸的基于磁性納米粒子修飾的酶傳感器的制備方法包括以下步驟:首先將鎳修飾的磁性納米粒子與所述PP2A酶偶聯(lián)吸附連接形成磁性納米粒子修飾的PP2A酶，然后將該磁性納米粒子修飾的PP2A酶通過光交聯(lián)法或瓊脂糖包埋法固定在所述工作電極上。
[0013]所述鎳修飾的磁性納米粒子與所述PP2A酶偶聯(lián)吸附連接包括以下步驟:(I)將15?30ul的N1-1DA磁性納米粒子膠狀懸浮液加入到預裝有150?300ul結(jié)合緩沖液的容器中，并用所述結(jié)合緩沖液清洗，以去除非特異性結(jié)合，所述結(jié)合緩沖液的PH為8-8.5，含有Tris - HCl、NaCl以及疊氮化鈉；
[0014](2)將I?2個單位PP2A酶/ul的PP2A酶溶液加入到所述容器中，以600-1000轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速震搖所述容器10?20min，以使所述磁性納米粒子與所述PP2A酶充分偶聯(lián)吸附結(jié)合，所述PP2A酶溶液與所述N1-1DA磁性納米粒子膠狀懸浮液的體積比為50?100:3，所述I單位PP2A酶為在25°C下Imin內(nèi)裂解所述對硝基苯磷酸二鈉鹽所需的酶量；
[0015](3)用所述結(jié)合緩沖液清洗所述磁性納米粒子，以去除非結(jié)合的所述PP2A酶。
[0016]作為優(yōu)選，所述結(jié)合緩沖液為pH7.5的20mM Tris溶液，該Tris溶液含有500mMNaCl和0.09%疊氮化鈉。
[0017]上述光交聯(lián)法的具體步驟為:
[0018](I)將所述磁性納米粒子修飾的PP2A酶溶解在pH8?8.5緩沖液A中制成I?2個單位/ul的固定酶溶液，在該酶溶液中加入PVA-AWP，所述PP2A酶與所述PVA-AWP的質(zhì)量比為I?2:1，均質(zhì)后形成固定溶液，所述緩沖液A包含Tris - HCl、EDTA以及MgCl2，所述I單位磁性納米粒子修飾的PP2A酶為在25°C下Imin內(nèi)裂解所述對硝基苯磷酸二鈉鹽所需的酶量；
[0019](2)然后滴加2.5?3.5ul所述固定溶液至工作電極表面，3?5°C下在功率為12?15W的日光燈下照射3?6h ;
[0020](3)光照后，3?5°C下干燥12?24h，干燥后用雙蒸水沖洗，以去除物理吸附的多余的磁性納米粒子修飾的PP2A酶，最后將制得的固定化磁性納米粒子修飾的PP2A酶電極在4°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0021]作為優(yōu)選，所述緩沖液A 包含 30mM Tris _HCl、2mM EDTA 和 20mM MgCl20
[0022]所述瓊脂糖包埋法的具體步驟為:(I)將0.1?0.2g瓊脂糖加入到50?10mlpH為8?8.7的Tris - HCl緩沖液中，55?65°C加熱4?6min，充分溶解后得瓊脂糖溶液，待該瓊脂糖溶液降溫至20?27°C時，將磁性納米粒子修飾的PP2A酶加入到瓊脂糖溶液中并充分混合形成混合液，該混合液中磁性納米粒子修飾的PP2A酶的濃度為I?2個單位PP2A酶/ul，其中所述I單位磁性納米粒子修飾的PP2A酶為在25°C下Imin內(nèi)裂解所述對硝基苯磷酸二鈉鹽所需的酶量；
[0023](2)上述混合液3?5°C放置11?13h后，取2.5?3.5ul滴涂于所述工作電極表面，室溫下干燥成膜5?6h ;
[0024](3)干燥后用雙蒸水沖洗，以去除物理吸附的多余的PP2A酶，最后將制得的固定化PP2A酶電極在4°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0025]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:本發(fā)明中PP2A酶通過磁性納米粒子修飾，由于納米粒子表面呈球狀，因此其比表面積遠大于平面結(jié)構，單位體積內(nèi)可以負載更多的反應酶，從而提高工作電極表面PP2A酶的負載率，提高該酶傳感器的檢出敏感性，本發(fā)明制備的磁性納米粒子修飾的PP2A酶傳感器，其電流的響應值比普通PP2A酶傳感器提高10倍以上。同時本發(fā)明利用大田軟海綿酸對PP2A酶活力的抑制作用制成以PP2A酶為固定化酶層的生物傳感器，通過PP2A酶活性抑制的程度測定樣品中大田軟海綿酸含量的高低，即將樣品中大田軟海綿酸濃度轉(zhuǎn)換為電信號進行檢測，檢測結(jié)果更加直觀，同時利用PP2A酶促反應的專一性和高效性，使得檢測過程特異性高，檢測結(jié)構準確率高，同時檢測周期短，可實現(xiàn)即時、快速檢測的需要，本發(fā)明用于檢測水產(chǎn)品大田軟海綿酸時，檢出限低于0.20 μ g/L、重現(xiàn)性RSD〈5%，檢測耗時小于0.5h。
【附圖說明】
[0026]圖1為本發(fā)明中用于檢測貝類毒素大田軟海綿酸的基于磁性納米粒子修飾的酶傳感器的結(jié)構示意圖；
[0027]圖2為圖1中酶傳感器的原理示意圖；
[0028]圖3為本發(fā)明中磁性納米粒子與PP2A酶通過N1-His吸附固定示意圖；
[0029]圖4本發(fā)明中不同濃度的標準液中大田軟海綿酸對PP2A酶活性的抑制率(％)。
【具體實施方式】
[0030]以下結(jié)合附圖實施例對本