86%而miR-150表達(dá)下降了 63% (自測數(shù)據(jù)）和62% (Jacob等人發(fā)表數(shù)據(jù))，可W看出；miR-34a的變化幅度比miR-150的變 化幅度更為明顯。
[0016] 表2.福射后24小時(shí)循環(huán)血中miR-34a表達(dá)上升與miR-150表達(dá)下降的比較
此外，比較福照后不同時(shí)間點(diǎn)（6、12、24、48和72小時(shí))，循環(huán)血11111?-343表達(dá)水平的變 化情況，結(jié)果如圖1所示，在福照后的6~72小時(shí)，miR-34a表達(dá)水平均有明顯提高，且在48 小時(shí)最高，因此，該一特征可W作為常規(guī)福照實(shí)驗(yàn)研究中判斷動(dòng)物是否受到照射的一種新 方法，W增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
[0017] 2、由于miRNA在不同物種間具有高度的保守性，W動(dòng)物模型得出的研究結(jié)果也適 宜于人體的借鑒和參考。因此，本發(fā)明循環(huán)血miR-34a作為物理劑量計(jì)測量結(jié)果的有益補(bǔ) 充，可用于意外福射事件中人和動(dòng)物受照射情況的監(jiān)控，有效提高評(píng)估福射風(fēng)險(xiǎn)和福射危 害的準(zhǔn)確性。
【附圖說明】
[0018] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0019] 圖1為本發(fā)明小鼠經(jīng)X射線照射后循環(huán)血中miR-34a表達(dá)水平隨時(shí)間推移的變化 趨勢（*表示P<〇. 05，**表示p<0. 01，每一時(shí)間點(diǎn)均是與對(duì)照組化相比較)。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 循環(huán)血miR-34a作為福射生物標(biāo)志物在福射監(jiān)控中的應(yīng)用，該循環(huán)血miR-34a是 指按常規(guī)方法從動(dòng)物或人的血清中提取獲得，其用于非均勻照射或意外照射大于化的條 件下判斷照射及福射對(duì)動(dòng)物或人的損傷程度。
[0021] 其中；福射的種類包括X射線、r射線等電磁福射及電子、質(zhì)子、碳離子、鐵離子等 粒子福射。 實(shí)施例
[0022] 用0、0. 5、2. 0和4.OGy的X射線照射小鼠，每個(gè)處理組6只小鼠。雙盲法進(jìn)行X 射線照射和循環(huán)血miR-34a表達(dá)水平檢測： 1.血清的提?。辉诟Ｉ涫录l(fā)生后（6~7化均可)，采集需要鑒定的動(dòng)物或人的全血至 無RNA酶的EP管中，整個(gè)過程避免劇烈晃動(dòng)，并且不要讓雜質(zhì)落入管中，W防溶血。同時(shí)采 集沒有照射的動(dòng)物或人的全血作為對(duì)照。將全血在室溫下放置比，3000r/min離屯、10分 鐘，吸取上層澄清的血清，放入新的無RNA酶管中，10000r/min離屯、10分鐘，即可分離得到 檢測所需的血清樣品，并可儲(chǔ)存于-80°C保存。
[002引 2.RNA的純化：由于血清樣品中RNA的豐度較低，可W用QIAGE肥公司的miRNeasy Serum/PlasmaKit試劑盒純化。在提取之前，加入外源線蟲cel-miR-39作為內(nèi)參，用于PCR反應(yīng)后數(shù)據(jù)的歸一化處理。具體操作過程如下： C0融化血清樣品，加入5倍于樣品體積的QIAzolLysisReagent(有毒，有腐蝕性)，禍 旋混勻。如 200ul血清需加入 1mlQIAzolLysisReagent。
[0024] 口)室溫下靜置 5min，加入 3.加 1cel-miR-39 (1. 6Xl〇8copies/ul)。
[0025] 樹加入和開始樣品等體積氯仿，蓋上蓋子，用力搖晃15s。
[0026](4)在室溫下解化 2~3min。4°C，12000r/min離屯、15min。
[0027] 腳移取上清到新的EP管中，并避免吸到任何中間相。加入1. 5倍體積的100%酒 精，吹打混勻。
[0028] (6)最多吸取700ul樣本，加入到RNea巧MinElutespincolumn，（用于聚集溶液 中的核酸，試劑盒有提供）。室溫，> 8000r/min離屯、Imin，棄掉流出液。
[0029] (7)剩余的樣本重復(fù)上一步。
[0030] 佩加入 700ulBufferRWT到RNeasyMi址lutespincolumn。室溫，> 8000r/ min離屯、30s，棄掉流出液。
[003U佩吸取 500ulBufferR陽到RNeasyMi址lutespincolumn。室溫，> 8000r/min離屯、30s，棄掉流出液。
[003引 朋)加入 500ul80% 酒精到RNeasyMi址lutespincolumn。室溫，> 8000r/min， 離屯、1. 5min。
[0033] ⑩把RNeasyMi址lutespincolumn放入新的收集管中，滿速下離屯、5min，再打開 蓋子驚干5min。
[0034] 腳把RNeasyMi址lutespincolumn放入新的 1. 5ml無RNA酶EP管中。將 20 ulRNase-化eewater直接加入到spincolumn膜的中屯、。輕輕關(guān)上蓋子，滿速下離屯、2min 洗提RNA。
[0035] 3.RNA的反轉(zhuǎn)錄；義用AU-in-〇neFirst-standcDNASythesisKit(Gene Copoeia)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA聚合物用于下游的實(shí)時(shí)巧光定量PCR (qRT-PCR)檢測。反應(yīng)體系如表3 ; 表3
反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?7°C下反應(yīng)60min，85°C下滅火5min。
[0036] 4.miR-34a引物設(shè)計(jì)；miR-34a的引物設(shè)計(jì)可W直接由公司完成，本流程采用的是 GeneCopoeia公司設(shè)計(jì)和生產(chǎn)的All-in-〇ne?miRNAqPCRPrimer。
[0037] 5.miR-：Ma的qRT-PCR檢：;采用AU-in-oneTMmiRNAqRT-PCRDetection Kit(GeneCopoeia)試劑盒進(jìn)行血清miR-34a的定量檢測，具體操作過程如下；融解 All-in-〇nemiRNAqRT-PCRDetectionKit中的2XAU-in-〇neqPCRmix,混勻、短暫離 心后置冰上待用。反應(yīng)體系如表4 ; 表4
反應(yīng)程序如表5 ;為保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，每個(gè)樣本加3個(gè)復(fù)孔。
[00%]表 5
數(shù)據(jù)分析；反應(yīng)所得到的ct值，利用a法進(jìn)行分析，公式如下； 變化倍數(shù)（Foldchange)=2-AAGt，AACt=ACt(q)-ACt(O) 其中，ACt(q)=Ct(q)x-Ct(q)n為待鑒定樣品Ct值之差，ACt(0) =Ct(0)x-Ct(0)n為 對(duì)照樣品Ct值之差，X代表miR-34a的Ct值，n代表線蟲cel-miR-39 (內(nèi)參）的Ct值。 [0039] 結(jié)果判定；如果數(shù)據(jù)分析中的變化倍數(shù)大于1. 5,即可判定待鑒定樣品的循環(huán)血 miR-34a表達(dá)水平明顯提高。結(jié)果表明，各受照射組小鼠的循環(huán)血miR-34a表達(dá)水平都比未 受到照射組明顯提高了 2~4倍，并且隨著照射劑量的增加，miR-34a表達(dá)水平呈現(xiàn)增加的趨 勢。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.循環(huán)血miR-34a作為輻射生物標(biāo)志物在輻射監(jiān)控中的應(yīng)用，其特征在于：該循環(huán)血 miR-34a是指按常規(guī)方法從動(dòng)物或人的血清中提取獲得，其用于非均勻照射或意外照射大 于6h的條件下判斷照射及輻射對(duì)動(dòng)物或人的損傷程度。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種循環(huán)血miR-34a作為輻射生物標(biāo)志物在輻射監(jiān)控中的應(yīng)用，該循環(huán)血miR-34a是指按常規(guī)方法從動(dòng)物或人的血清中提取獲得，其用于非均勻照射或意外照射大于6h的條件下判斷照射及輻射對(duì)動(dòng)物或人的損傷程度。本發(fā)明循環(huán)血miR-34a作為物理劑量計(jì)測量結(jié)果的有益補(bǔ)充，可用于意外輻射事件中人和動(dòng)物受照射情況的監(jiān)控，有效提高評(píng)估輻射風(fēng)險(xiǎn)和輻射危害的準(zhǔn)確性。
【IPC分類】G01N33/49
【公開號(hào)】CN104977398
【申請?zhí)枴緾N201510333137
【發(fā)明人】王菊芳, 危文俊, 王潔, 丁楠, 何進(jìn)鵬
【申請人】中國科學(xué)院近代物理研究所
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2015年6月16日