檢測(cè)噻蟲啉的elisa試劑盒及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種用于定量檢測(cè)唾蟲咐殘留量的酶聯(lián)免疫 試劑盒及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 酶聯(lián)免疫分析法（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)作為新興的農(nóng)藥 殘留檢測(cè)方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、投入少、測(cè)定結(jié)果可靠等優(yōu) 點(diǎn)。美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)（A0AC)已將免疫分析與氣相色譜、液相色譜同列為農(nóng)藥殘留檢測(cè)的S大 支柱技術(shù)。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署扣SEPA)、美國(guó)農(nóng)業(yè)部食品安全檢驗(yàn)司（FSIS-USDA)和美國(guó)化 學(xué)學(xué)會(huì)制定了農(nóng)藥殘留免疫檢驗(yàn)商品試劑盒評(píng)定和認(rèn)可的建議準(zhǔn)則，明確了測(cè)定結(jié)果的法 律效應(yīng)。自從Hammock等首次將免疫技術(shù)用于農(nóng)藥殘留分析W來(lái)，已有幾十余種農(nóng)藥建立 了酶聯(lián)免疫分析方法，幾乎包括了殺蟲劑、殺菌劑、除草劑、植物（昆蟲）生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等所有 農(nóng)藥類別，其中殺蟲劑有對(duì)硫磯、亞胺硫磯、甲基對(duì)硫磯、殺懼硫磯、甲基毒死婢、=挫磯、毒 死婢、甲胺磯、西維因、快喃丹、氯戊菊醋、滅多威等；殺菌劑有S挫酬、唾菌靈、克菌丹、異菌 瞇、硝苯挫、福美雙等；除草劑有草甘麟、百草枯、2, 4-D、阿特拉津、麥草畏、西瑪津、化草胺、 撲草凈、精嗟禾靈、氯橫隆等；植物（昆蟲）生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有抑芽丹、氣蟲脈、甲氧保幼激素等。
[0003] 唾蟲咐是德國(guó)拜耳農(nóng)用化學(xué)品公司開發(fā)的新型氯代煙堿類殺蟲劑，主要作用于昆 蟲神經(jīng)接合后膜，通過(guò)與煙堿己酷膽堿受體結(jié)合，干擾昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)正常傳導(dǎo)，引起神經(jīng)通 道的阻塞，造成己酷膽堿的大量積累，從而使昆蟲異常興奮，全身疫李、麻搏而死。該種農(nóng)藥 作用特點(diǎn)是；具有較強(qiáng)的內(nèi)吸、觸殺和胃毒作用，既可用于莖葉處理，也可用于±壤、種子處 理。能夠防治水稻、蔬菜、果樹、棉花和馬鈴馨等作物上的大多數(shù)害蟲，對(duì)稻萄馬、稻飛風(fēng)等 害蟲有較好的防治效果。隨著唾蟲咐使用范圍和用量的增大，其在水體、±壤乃至農(nóng)產(chǎn)品 中檢出頻率和檢出濃度越來(lái)越高。發(fā)展環(huán)境中痕量唾蟲咐的分析方法，是研究唾蟲咐的環(huán) 境行為和科學(xué)評(píng)估唾蟲咐環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的前提。目前對(duì)唾蟲咐的分析主要使用高效液相色譜 法（HPLC)，如韓振泰等采用HPLC法檢測(cè)白蠟枝葉中唾蟲咐的含量方法回收率達(dá)到95. 7~ 97. 8%，檢測(cè)限為0.Olmgm。，該方法具有很強(qiáng)的代表性，可行性很強(qiáng)；胡敏等使用反向 HPLC測(cè)定蔬果中的唾蟲咐含量，該方法穩(wěn)定，變異系數(shù)小于0. 201 %，回收率高達(dá)99. 89%。 但是，儀器檢測(cè)方法還存在諸多不足，如測(cè)試成本高、分析時(shí)間長(zhǎng)、前處理步驟繁瑣及對(duì)操 作人員要求較高等，不能滿足環(huán)境水體、±壤、農(nóng)產(chǎn)品等中唾蟲咐殘留的快速檢測(cè)的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)唾蟲咐的化ISA試劑盒，其 檢測(cè)靈敏、準(zhǔn)確、快速，操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)，適用于大批樣品的檢測(cè)。
[0005] 本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述化ISA試劑盒的制備方法。
[0006] 本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述化ISA試劑盒的應(yīng)用。
[0007] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0008] -種檢測(cè)唾蟲咐的ELISA試劑盒，它包括；用唾蟲咐包被抗原包被的酶標(biāo)板、唾蟲 咐標(biāo)準(zhǔn)品、唾蟲咐多克隆抗體工作液、唾蟲咐酶標(biāo)二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液 和濃縮洗漆液。
[0009] 其中，所述的唾蟲咐包被抗原包被的酶標(biāo)板按如下方法制備得到；將唾蟲咐半抗 原與卵清白蛋白（OVA)偶聯(lián)得到唾蟲咐包被抗原附著于酶標(biāo)板中。
[0010] 其中，所述的唾蟲咐半抗原的制備方法記載于中國(guó)專利2015103352632中，專利 名稱是一種唾蟲咐半抗原的合成方法。具體方式是：在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將唾蟲咐、琉基丙酸 (3-MPA)和氨氧化鐘化0H)混合，然后加入二甲亞諷值MS0)，攬拌至全部溶解；緩慢升溫至 95~100°C，在95~100°C保溫反應(yīng)2~化；將反應(yīng)體系降溫至20~25°C，向該反應(yīng)體系 中加水，隨后使用鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的抑值至3~4 ;向反應(yīng)體系中加S氯甲燒進(jìn)行萃取， 收集下層有機(jī)層；用鹽酸調(diào)節(jié)有機(jī)層液體的抑值至5~6,抽濾，濾液減壓脫干得到的固體 用甲醇打漿溶解，過(guò)濾，濾液減壓脫干得到產(chǎn)物；產(chǎn)物過(guò)硅膠柱，旋蒸，得到唾蟲咐半抗原純 品。
[0011] 其中，所述的唾蟲咐標(biāo)準(zhǔn)品，其溶質(zhì)唾蟲咐的濃度為4. 096yg/ml，溶劑為水。
[0012] 其中，所述的唾蟲咐多克隆抗體工作液是采用唾蟲咐人工抗原免疫兔制得唾蟲咐 多克隆抗體，再將唾蟲咐多克隆抗體用稀釋液按體積比稀釋成1:3200的比例，所述的稀釋 液為含5mg/mlBSA的PBS溶液。
[0013] 其中，所述的唾蟲咐酶標(biāo)二抗工作液是將酶標(biāo)二抗用稀釋液按體積比稀釋成 1:5000的比例，所述的稀釋液為含5mg/mlBSA的PBS溶液。
[0014] 其中，所述的底物液A為含有0. 5mmol/L的過(guò)氧化氨脈的巧樣酸-磯酸氨二鋼緩 沖溶液（P冊(cè).0~5. 4);所述的底物液B為2mg/ml的四甲基聯(lián)苯二胺的己醇溶液；所述的 終止液為2mol/L的硫酸水溶液；所述濃縮洗漆液是10倍濃縮洗漆液，所述濃縮洗漆液為 0.Olmol/L、抑 7. 0 ~7. 5 的PBST(注；lOOmLPBST中含 0. 5血吐溫-20)。
[0015] 上述檢測(cè)唾蟲咐的化ISA試劑盒的制備方法，它包括如下步驟：
[0016] (1)用唾蟲咐包被抗原包被的酶標(biāo)板的制備：
[0017] 將唾蟲咐半抗原與卵清白蛋白偶聯(lián)得到唾蟲咐包被抗原，將唾蟲咐包被抗原稀釋 成0. 25yg/ml，100化/孔在酶標(biāo)板上點(diǎn)樣，4, °C過(guò)夜；取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用10倍 稀釋后的濃縮洗漆液300yL/孔洗板3次，30s/次；然后加入含5mg/mlBSA的PBS溶液封 閉，380yL/孔在上述酶標(biāo)板上點(diǎn)樣，37°C放置化，用10倍稀釋后的濃縮洗漆液300yL/孔 洗板3次，30s/次，拍干；將酶標(biāo)板真空密封后置4°C下保存；
[0018] 其中，將唾蟲咐半抗原與卵清白蛋白偶聯(lián)得到唾蟲咐包被抗原，具體步驟為：取 0. 2mmol唾蟲咐半抗原，溶于3血無(wú)水N,N-二甲基甲酯胺值MF)，加入46mgN-哲基了二酷 亞胺（N服）和78mg1-(3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亞胺鹽酸鹽巧DC) ?肥L。室溫避 光攬拌反應(yīng)過(guò)夜。取44mg卵清白蛋白（OVA)溶于15mL棚酸鹽緩沖液（0. 2mol/L，p服.7)。 然后在比內(nèi)將上述過(guò)夜活化的半抗原溶液加入OVA溶液中，使半抗原與OVA的摩爾比約為 30:1，室溫?cái)埌璺磻?yīng)化后，于4°C反應(yīng)過(guò)夜。用蒸饋水透析3d，每天換水3次，透析液冷凍 干燥即得唾蟲咐包被抗原（T肥-OVA)。
[0019] (2)唾蟲咐標(biāo)準(zhǔn)品的制備；
[0020] 稱取0. 0004g唾蟲咐標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸饋水定容至100血，得到濃度為4096ng/mL的 母液，依次按二倍比稀釋，分別得到濃度為2048ng/血、1024ng/血、512ng/血、256ng/血、 128ng/血、64ng/血、3化g/血、16ng/mL、8ng/血、4ng/mL、化g/血、Ing/血的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同時(shí) 補(bǔ)充空白Ong/mL的柄;準(zhǔn)品洛濃。
[0021] (3)唾蟲咐多克隆抗體工作液的制備；
[0022] 采用唾蟲咐人工抗原免疫兔制得唾蟲咐多克隆抗體，將唾蟲咐多克隆抗體用稀釋 液按體積比稀釋成1:3200的比例即得，所述的稀釋液為含5mg/mlBSA的PBS溶液；
[0023] 其中，采用唾蟲咐人工抗原免疫兔制得唾蟲咐多克隆抗體，具體步驟為：選用3月 齡健康大白兔，通過(guò)S次免疫，第1周給家兔注射卡介苗0. 2mL/只（約15mg)，采耳血，備 用。首次免疫用完全佐劑〇.5mL加抗原Img，充分混勻，背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射。2周后進(jìn)行加 強(qiáng)免疫，不完全佐劑0. 5mL加抗原0. 5mg，充分混勻，背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射。4周后進(jìn)行二次加 強(qiáng)免疫，不完全佐劑0. 5mL加抗原0. 5mg，充分混勻