一種堿性磷酸酶的酶促化學(xué)發(fā)光底物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫技術(shù)檢測領(lǐng)域，特別涉及可用于化學(xué)發(fā)光免疫檢測的一種高效酶 促化學(xué)發(fā)光底物。
【背景技術(shù)】
[0002] 化學(xué)發(fā)光是指在一個(gè)反應(yīng)體系中通過化學(xué)反應(yīng)生成一種激發(fā)態(tài)的產(chǎn)物（(f)，在其 回到基態(tài)的過程中，釋放出的能量轉(zhuǎn)變成光子（能量hY)，從而產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。
[0003] 化學(xué)發(fā)光免疫分析是繼酶免技術(shù)、放免技術(shù)、熒光免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種 超高靈敏度的微量檢測技術(shù)，具備靈敏度高、檢測范圍寬、操作簡便快速、標(biāo)記物穩(wěn)定性好、 無污染等優(yōu)點(diǎn)，因此成為世界范圍內(nèi)發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析技術(shù)，是目前免疫 定量分析最理想的方法。
[0004] 在化學(xué)發(fā)光免疫分析中，常用發(fā)光物質(zhì)包括魯米諾、異魯米諾、吖啶酯、1，2-二氧 雜環(huán)丁燒化合物（l，2-dioxetanecompound)。其中異魯米諾和吖啶醋作為示蹤分子直接 標(biāo)記，屬于閃光型化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。魯米諾和1，2-二氧雜環(huán)丁烷化合物依靠酶作為示蹤分 子標(biāo)記，屬于酶促輝光型化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。1，2-二氧雜環(huán)丁烷化合物是最新的超靈敏的堿 性磷酸酶（Alkalinephosphatase,AP)底物，在適宜的緩沖液中，隨著堿性磷酸酶（AP)的 催化水解作用，1，2-二氧雜環(huán)丁烷化合物分解發(fā)出的信號(hào)可持續(xù)20小時(shí)以上，是理想的化 學(xué)發(fā)光物質(zhì)。國外生產(chǎn)廠家研制出以堿性磷酸酶（AP)為標(biāo)記物，1，2-二氧雜環(huán)丁烷化合 物-3-(2-螺旋金剛烷）-4-甲氧基-4-(3-磷酰氧基）苯-1，2-二氧雜環(huán)丁烷（AMPPD)為 底物的試劑盒，與之相匹配的有DPC、AccessSubstrate、BioMerieux、Olympus全自動(dòng)化學(xué) 發(fā)光系統(tǒng)。
[0005] 然而AP催化AMPH)的化學(xué)反應(yīng)是水解反應(yīng)，雖然具有較長的平臺(tái)期，但是其發(fā)光 強(qiáng)度較低，并且起光較慢，因此，該化學(xué)反應(yīng)仍有待優(yōu)化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)光信號(hào)強(qiáng)、進(jìn)入平臺(tái)期較 快、持續(xù)時(shí)間長、常溫保存期長的堿性磷酸酶的酶促化學(xué)發(fā)光底物。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0008] -種堿性磷酸酶的酶促化學(xué)發(fā)光底物，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物以水為溶 劑，含有以下組分：
[0009] 2-氨基-2-甲基-1-丙醇；
[0010]AMPPD；
[0011] 以及脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸鈉與熒光化合物偶聯(lián)的發(fā)光增強(qiáng)劑（記作H0BEP系列 化合物）。
[0012] 脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸鈉與熒光化合物的偶聯(lián)可起到共表面活性劑的作用，能使 該復(fù)合物更好的結(jié)合到化學(xué)發(fā)光緩沖體系中。
[0013] 當(dāng)H0BEP系列化合物溶于水后，在濃度較低時(shí)呈單分子分散狀態(tài)，或被吸附在溶 液的表面上，從而降低表面張力；而H0BEP系列化合物的濃度增加至溶液表面已經(jīng)飽和而 不能再吸附時(shí)，其分子即開始轉(zhuǎn)入溶液內(nèi)部，由于H0BEP系列化合物分子的疏水部分與水 的親和力較小，而疏水部分之間的吸引力較大，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，許多H0BEP系列化合物 的疏水部分便相互吸引，締合在一起，形成締合體，即膠束，可觸發(fā)從激發(fā)態(tài)裂解產(chǎn)物到熒 光表面活性劑之間的能量轉(zhuǎn)移，因此可大幅度提高化學(xué)發(fā)光效率。
[0014] 其中，所述發(fā)光增強(qiáng)劑的結(jié)構(gòu)式為以下的式（I)、式（II)、式（III)、式（IV)及 式（V)的其中一種：
[0015] (l)HOBEP-l:與香豆素類熒光化合物偶聯(lián)
[0016]
[0017] (2)H0BEP_2 :與熒光素類熒光化合物偶聯(lián)
[0018]
[0019] (3)H0BEP_3 :與萘酰亞胺類熒光化合物偶聯(lián)
[0020]
[0021] (4)H0BEP_4 :與羅丹明類熒光化合物偶聯(lián)
[0022]
[0023] (5)H0BEP_5 :與苯并咪唑類熒光化合物偶聯(lián)
[0024]
[0025]其中，
[0026] &選自Ci_28烷基的其中一種；
[0027]R2選自以下取代基中的其中一種：鹵素、羥基、疏基、氛基、硝基、烷基、烷氧基、齒 代烷基、氨基、烷基氨基、酰胺基；
[0028] n取5-10的整數(shù)。
[0029] 在具體實(shí)施例中，所述酶促化學(xué)發(fā)光底物還含有MgS04、ZnCl2及防腐劑。
[0030] 作為優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】，本發(fā)明的酶促化學(xué)發(fā)光底物以水為溶劑，含有以下組 分：
[0031]
[0032]
[0033] 在具體實(shí)施例中，所述防腐劑為ProClin300。
[0034] 本發(fā)明的堿性磷酸酶的酶促化學(xué)發(fā)光底物（APSH)的空白發(fā)光強(qiáng)度不高于200,檢 測靈敏度達(dá)到l〇-19molAP。此外，將本發(fā)明的酶促化學(xué)發(fā)光底物分別于37°C放置10天， 4°C放置18個(gè)月進(jìn)行穩(wěn)定性研宄的結(jié)果表明，本發(fā)明提供的酶促化學(xué)發(fā)光底物（APSH)熱穩(wěn) 定性及實(shí)時(shí)穩(wěn)定性均極好，能達(dá)到化學(xué)發(fā)光儀器檢測的要求?？傮w而言，本發(fā)明提供的新型 化學(xué)發(fā)光底物（APSH)強(qiáng)度高，靈敏度高，持續(xù)時(shí)間長，可達(dá)30-60min，穩(wěn)定性好，可完全滿 足臨床檢測的需要，其主要性能指標(biāo)已達(dá)到國外產(chǎn)品水平，大大降低了化學(xué)發(fā)光底物的成 本。
【附圖說明】
[0035] 圖1為實(shí)施例二的酶促化學(xué)發(fā)光底物（ASPH)及貝克曼化學(xué)發(fā)光底物（Access Substrate)在不同濃度AP條件下信號(hào)強(qiáng)度差異比較示意圖。
[0036] 圖2為實(shí)施例三的酶促化學(xué)發(fā)光底物（ASPH)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研宄實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 實(shí)施例一、酶促化學(xué)發(fā)光底物（APSH)的制備
[0038] ⑴材料：2_氨基-2-甲基-1-丙醇、AMPPD、MgS04及ZnCl2均為市售，化學(xué)純； ProClin300為美國Supelco公司產(chǎn)品；發(fā)光增強(qiáng)劑H0BEP-1為通過脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸 鈉與香豆素類熒光化合物偶聯(lián)得到，發(fā)光增強(qiáng)劑H0BEP-2為通過脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸鈉 與熒光素類熒光化合物偶聯(lián)得到，發(fā)光增強(qiáng)劑H0BEP-3為通過脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸鈉與 萘酰亞胺類熒光化合物偶聯(lián)得到，發(fā)光增強(qiáng)劑H0BEP-4為通過脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸鈉與 羅丹明類熒光化合物偶聯(lián)得到，發(fā)光增強(qiáng)劑H0BEP-5為通過脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸鈉與苯 并咪唑類熒光化合物偶聯(lián)得到。
[0039] (2)以超純水為溶劑，按表1. 1，表1. 2,表1. 3分別制備最低高濃度、最佳濃度和最 低濃度的酶促化學(xué)發(fā)光底物APSH-1，按表2. 1，表2. 2,表2. 3分別制備最低高濃度、最佳濃 度和最低濃度的酶促化學(xué)發(fā)光底物APSH-2,按表3. 1，表3. 2,表3. 3分別制備最低高濃度、 最佳濃度和最低濃度的酶促化學(xué)發(fā)光底物APSH-3,按表4. 1，表4. 2,表4. 3分別制備最低高 濃度、最佳濃度和最低濃度的酶促底物化學(xué)發(fā)光底物APSH-4,按表5. 1，表5. 2,表5. 3分別 制備最低高濃度、最佳濃度和最低濃度的酶促化學(xué)發(fā)光底物APSH-5 :
[0040]表 1. 1APSH-1 的配方一
[0041]
[0042]表 1. 2APSH-1 的配方二
[0043]
[0044] 表1. 3APSH-1的配方三
[0045]
[0046]
[0047] 表2. 1APSH-2的配方一
[0048]
[0049] 表2. 2APSH-2的配方二
[0050]
[0051] 表2. 3APSH-2的配方三
[0052]
[0053] 表3. 1APSH-3的配方一
[0054]
[0055]
[0056] 表3. 2APSH-3的配方二
[0057]
[0058] 表3. 3APSH-3的配方三
[0059]
[0060] 表4. 1APSH-4的配方一
[0061]
[0062] 表4. 2APSH-4的配方二
[0063]
[0064] 表4. 3APSH-4的配方三
[0065]
[0066] 表5. 1APSH-5的配方一
[0067]
[0068] 表5. 2APSH-5的配方二
[0069]
[0070]
[0071] 表5. 3APSH-5的配方三
[0072]
[0073] 實(shí)施例二、比較本實(shí)施例酶促化學(xué)發(fā)光底物（APSH)與貝克曼化學(xué)發(fā)光底物 (AccessSubstrate)測試各梯度濃度AP信號(hào)強(qiáng)度及線性關(guān)系