一種區(qū)分乳腺癌亞型生物標(biāo)志物的組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤生物標(biāo)記物領(lǐng)域，具體涉及一組乳腺癌分子亞型的生物標(biāo)志物的 組合物，該組合物來源于血漿內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物，該組合物對于快速區(qū)分乳腺癌的分 子亞型和臨床個體化治療具有重要意義。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是女性中最為常見的惡性腫瘤，具有很強的異質(zhì)性，近年來其發(fā)病率和死 亡率均在逐漸增高。乳腺癌患者中人表皮生長因子受體2(HER2)是一種原癌基因，它的 高水平表達提示患者容易出現(xiàn)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，臨床建議使用相應(yīng)的分子靶向藥物進行干 預(yù)。雌激素受體（ER)的表達是應(yīng)用內(nèi)分泌藥物治療不可或缺的重要依據(jù)。根據(jù)HER2和ER 的基因表達情況，可將乳腺癌分為4種分子亞型：LuminalA型（ER+、HER2-)、Luminal B型 (ER+、HER2+)、HER2 過表達型（ER-、HER2+)和 Basal-like 型（ER-、HER2-)。
[0003] 確定乳腺癌分子分型是個體化治療的基礎(chǔ)。目前，臨床上主要通過活體組織檢查 法及后續(xù)的免疫組化法研宄癌細胞基因的表達情況來判斷乳腺癌的分子分型。但是，該方 法昂貴、耗時，對病人容易造成較大的創(chuàng)傷，且容易誤判。
[0004] 因此發(fā)展快速、無創(chuàng)的乳腺癌分子分型診斷方法尤為重要。有研宄表明，癌癥病人 的基因水平變化會在體內(nèi)內(nèi)源性小分子代謝物水平上有所呈現(xiàn)。血漿分析是臨床上常用的 一種疾病診斷方法，因其簡便、經(jīng)濟且相對無創(chuàng)的優(yōu)點而被廣泛采用。目前尚未有人使用血 漿代謝物水平區(qū)分乳腺癌分子分型。
[0005] 因此，應(yīng)用血漿代謝組學(xué)尋找生物標(biāo)志物以區(qū)分乳腺癌分子亞型的研宄策略對于 乳腺癌的臨床快速診斷及個體化治療具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明涉及一種區(qū)分乳腺癌亞型生物標(biāo)志物的組合物：哌啶酸、纈氨酸在制備區(qū) 分乳腺癌亞型生物標(biāo)志物的組合物的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明涉及一種區(qū)分乳腺癌亞型生物標(biāo)志物的組合物：哌啶酸、纈氨酸、脯氨酸、 異亮氨酸、亮氨酸、2-辛烯二酸在制備區(qū)分Luminal B型和HER2過表達型乳腺癌的標(biāo)志物 的組合物的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明涉及一種區(qū)分乳腺癌亞型生物標(biāo)志物的組合物：
[0009] 分別檢測HER2過表達型、Luminal B型患者的離體血漿
[0010] 與HER2過表達型相比，Luminal B型的哌啶酸下調(diào)，纈氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、亮 氨酸、2-辛烯二酸上調(diào)。
[0011] 本發(fā)明涉及一種區(qū)分乳腺癌亞型生物標(biāo)志物的組合物：
[0012] 單位：提取離子流強度
[0013] 哌啶酸：Luminal B 型 2156672±45553、HER2 過表達型 2198270±79503 ;
[0014] 纈氨酸：Luminal B 型 1368882±182218、HER2 過表達型 1233138±265196 ;
[0015] 脯氨酸：Luminal B 型 1325183±55489、HER2 過表達型 1311271 ±79206 ;
[0016] 異亮氨酸：Luminal B 型 325054±5322、HER2 過表達型 224589±9743 ;
[0017] 亮氨酸：Luminal B 型 2548628±130655、HER2 過表達型 2301808±90442 ;
[0018] 2-辛烯二酸：Luminal B 型 1126470±42105、HER2 過表達型 1109990±70424。
[0019] 本發(fā)明涉及一種區(qū)分乳腺癌亞型生物標(biāo)志物的組合物：哌啶酸、纈氨酸、甘氨酸、 甘氨鵝去氧膽酸、棕櫚酸在制備區(qū)分Luminal A型和Basal-like型乳腺癌的標(biāo)志物的組合 物的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明涉及一種區(qū)分乳腺癌亞型生物標(biāo)志物的組合物：
[0021] 分別檢測LuminalA、Basal-like型患者中的離體血衆(zhòng)
[0022] 與Basal-like型相比，Luminal A型患者血衆(zhòng)中結(jié)|氨酸含量明顯上調(diào)，哌啶酸、甘 氨酸、甘氧鵝去氧膽酸及棕櫚酸明顯下調(diào)。
[0023] 本發(fā)明涉及一種區(qū)分乳腺癌亞型生物標(biāo)志物的組合物：
[0024] 單位：提取離子流強度
[0025] 哌啶酸：LuminalA型 217914±99803、Basal-like型 256884± 119445 ;
[0026] 纈氨酸：LuminalA型 1152199±294556、Basal-like型 892569± 141893 ;
[0027] 甘氨酸：LuminalA型 361960± 164984、Basal-like型 487493± 144298 ;
[0028] 甘氨鵝去氧膽酸：Luminal A 型 19579± 1680、Basal-like 型 27315± 1922 ;
[0029] 棕櫚酸：LuminalA型 264688±43895、Basal-like型 292127±35745。
[0030] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：應(yīng)用基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) 的非靶向代謝組學(xué)分析，結(jié)合多元數(shù)據(jù)分析處理方法，開展乳腺癌不同分子亞型患者的血 漿代謝組學(xué)研宄，尋找患者血漿中表征乳腺癌分子分型的內(nèi)源性小分子生物標(biāo)志物組合。
[0031] 檢測患者離體血漿：與HER2過表達型相比，Luminal B型患者血漿中脯氨酸、異亮 氨酸、亮氨酸、2-辛烯二酸及纈氨酸水平明顯上調(diào)，哌啶酸水平明顯下調(diào)；與Basal-like型 相比，Luminal A型患者血漿中纈氨酸水平明顯上調(diào)，哌啶酸、甘氨酸、甘氨鵝去氧膽酸及棕 櫚酸水平明顯下調(diào)。
[0032] 本發(fā)明的乳腺癌分子亞型的生物標(biāo)志物的確定過程如下：
[0033] 材料：乙腈及甲酸（UPLC純）購于美國ROE公司；色譜級別甲醇和氯仿購于江蘇漢 邦科技有限公司；氯化甲氧胺及N-甲基-N-(三甲基硅烷）三氟乙酰胺（含1%三甲基氯硅 燒）購于美國Sigma-Aldrich公司；去離子水由美國密理博（Millipore)公司的MIlli-Q超 純水系統(tǒng)制備；標(biāo)準(zhǔn)化合物包括：2_異丙基蘋果酸、谷氨酰胺、脯氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、 苯丙氨酸、副黃嘌呤、維生素C、蘋果酸、異亮氨酸、甘氨鵝脫氧膽酸、油酸、亞油酸、Y-亞麻 酸、乳酸、甘氨酸、草酸、亮氨酸、甘油、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、檸檬酸、D-果糖、D-葡萄 糖、棕櫚酸、硬脂酸及膽固醇，均購于美國Sigma-Aldrich公司。
[0034] 血漿標(biāo)本采集：96例乳腺癌患者術(shù)前外周靜脈血內(nèi)的血漿和年齡、性別與實驗組 相匹配的79例健康志愿者的外周靜脈血的血漿。所有的實驗者均有正常的心肺肝腎及造 血功能，米血時間均為清晨空腹?fàn)顟B(tài)。
[0035] 血漿樣品提取溶劑的優(yōu)選過程：
[0036] UPLC-Q/TOF-MS血漿樣品提取溶劑優(yōu)化：利用響應(yīng)面法進行實驗設(shè)計，以質(zhì)譜 ESI+和ESI-檢測模式下的峰個數(shù)和總峰面積為標(biāo)準(zhǔn)考察不同溶劑（乙腈、甲醇、乙醇、氯 仿、水），對血漿標(biāo)本的提取效率。將實驗測得數(shù)據(jù)進行多變量分析，在PLS模型中重要性 因子（variable importance to projection，VIP值）反映了這些變量對模型響應(yīng)的重要 性。乙腈、甲醇、乙醇、氯仿、水乙腈、水、甲醇、氯仿和乙醇的VIP值依次為1.503,0.802， 0. 651，0. 688和0. 987,結(jié)果表明乙腈的提取效率最高，故最終選擇乙腈作為血漿樣本的提 取溶劑。
[0037] 樣品的分析方法為：GC-Q/MS 和 UPLC-Q/TOF-MS。
[0038] 方法學(xué)考察：
[0039] 精密度：連續(xù)6針得到的儀器精密度RSD < 5%，說明實驗中儀器狀態(tài)良好。選取 血漿內(nèi)典型的兩種內(nèi)源性代謝物亮氨酸和甘氨酸，考察其日內(nèi)和日間精度。兩種代謝物日 內(nèi)精密度基本在RSD基本在5%~15%范圍內(nèi)，可以看出總體日間精度度的RSD大于日內(nèi) 精密度；穩(wěn)定性：實驗中選擇25°C進樣室溫度。結(jié)果顯示，三天中亮氨酸及甘氨酸穩(wěn)定性良 好。
[0040] 優(yōu)選的樣品制備及分析
[0041] GC-Q/MS
[0042] 樣品處理方法：取200yL血漿于1. 5mL離心管中，加入50yLlmg/mL的2-異 丙基蘋果酸溶液內(nèi)標(biāo)，渦旋20秒混勻，加入400yL甲醇、氯仿和水的混合溶液（比例為 2.5 : 1 : 1)，然后在 70°C 的金屬浴上振搖 30min(1200rpm)，16000gX5min離心（4°C)， 取500yL上清于1. 5mL離心管中，加入500yL蒸餾水，禍旋混勾，然后16000gX5min離心 (4°C )，取500 yL上清于1.5mL離心管中，在室溫下用氮吹儀吹干，所得殘渣用80yL的甲 氧胺吡啶溶液溶解，在50°C條件下肟化8h，加入60yLN-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺 試劑，在70°C條件下衍生化2h，即得。
[0043] GC-Q/MS條件：美國Agilent 7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。色譜柱HP-5MS 毛細管柱（30.0 mXO. 25mm，毛細管厚度0. 25 ym);載氣為高純氦氣，流速1. OmL/min ;進樣 量2 y L ;程序升溫：80°C恒溫2min，80°C -300°C (5°C /min)恒溫6min ;不分流，進樣溫度 300°C ;接口溫度300°C ;離子源溫度200°C ;電子能量50eV ;溶劑延遲3min ;采用全掃描模 式，掃描質(zhì)量范圍：m/z 30-600道爾頓。
[0044] UPLC-Q/TOF-MS ：
[0045] 樣品處理方法：取100 y L血漿于1. 5mL離心管中，加入400 y L乙腈，渦旋30秒后 混勻，13000rpmX10min離心（4°C )，取200 yL上清于1.5mL離心管中，在室溫下用氮吹儀 吹干，所得殘渣用300 y L的20%乙腈水溶液溶解，即得。
[0046] UPLC-Q/TOF-MS 條件：
[0047] 色譜分離采用超高效液相色譜系統(tǒng)（UPLC，Agilent 1290，USA)。色譜柱為Waters BH1 (：18柱（lOOmmX 2. 1mm，1. 7 y m)，柱溫25°C，進樣室溫度為室溫，進樣量2 y L〇
[0048] 正、負離子模式流動相組成均是A為體積濃度0. 1%甲酸水溶液，B為體積濃度 0. 1 %甲酸乙腈溶液。
[0049]梯度洗脫條件：0~lmin為0~30%B相，2min內(nèi)B相線性增加到60%，3~8min 線性變化至90B相，然后在8~9min線性增加至100%B相并保持lmin;流速0. 3mL/min， 柱后流出液不經(jīng)分流直接導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測。
[0050] 質(zhì)譜分析采用四級桿-飛行時間質(zhì)譜（Agilent 6530Q-T0