基于ipma的小反芻獸疫病毒抗體檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明提供一種基于免疫過(guò)氧化物酶細(xì)胞單層試驗(yàn)（immunoperoxidase monolayer assay，IPMA)的小反芻獸疫病毒抗體檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒能夠高特異性高 靈敏度地檢測(cè)小反芻動(dòng)物體內(nèi)是否存在小反芻獸疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV)抗體，從而達(dá)到疫苗抗體檢測(cè)或疾病診斷的目的。
【背景技術(shù)】
[0002] 小反合獸疫是小反合獸疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV)感染 引起的一種嚴(yán)重的烈性、接觸性傳染病，會(huì)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。該病為FA0/0IE規(guī)定的A 類烈性傳染病，我國(guó)規(guī)定的一類動(dòng)物疫病。
[0003] 其病原是副粘病毒科麻瘆病毒屬的成員，基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA。與 牛瘟病毒有相似的物理化學(xué)及免疫學(xué)特性。病毒可在胎綿羊腎、胎羊及新生羊的睪丸細(xì)胞、 Vero細(xì)胞上增殖，并產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE)，形成合胞體。只有一個(gè)血清型，但從遺傳演化上， 可分為4個(gè)系。
[0004] 該病自1942年在西非象牙海岸首次報(bào)道以來(lái)，目前主要流行于非洲西部、中東部 和亞洲的部分地區(qū)。2007年首次由境外傳入我國(guó)西藏，次年西藏又有傳染來(lái)源不明的疫情， 2013年底新疆再次發(fā)生，目前已有20各省市區(qū)出現(xiàn)疫情。傳染途徑主要為直接、間接接觸 或呼吸道飛沫傳播。傳染源主要為患病動(dòng)物和隱性感染動(dòng)物，處于亞臨床型的病羊尤為危 險(xiǎn)。其中病畜的分泌物和排泄物均能攜帶病毒。
[0005] PPRV主要感染小反芻獸，山羊比綿羊更易感，其它野生動(dòng)物也可發(fā)生。臨床上以發(fā) 熱、眼鼻分泌物、口炎、腹瀉和肺炎為特征。發(fā)病率和死亡率分別可高達(dá)100%和90%，其中 幼畜一般高于成年家畜。還常伴有繼發(fā)的呼吸道和胃腸道感染。
[0006] 對(duì)患畜尸體剖檢，可見結(jié)膜炎、壞死性口炎，嚴(yán)重病例可蔓延到硬腭及咽喉部。皺 胃、腸（尤其結(jié)直腸結(jié)合處）常出現(xiàn)糜爛、出血。淋巴結(jié)腫大，脾有壞死性病變。在鼻甲、喉、 氣管等處有出血斑。
[0007] 該病的初步診斷，可根據(jù)臨床癥狀和病理變化作出判斷，而確診需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢 查。其中，血清學(xué)診斷方法仍為常規(guī)采用的方法，包括：瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID)、沉淀抑制試 驗(yàn)（CIEP)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)、間接熒光抗體試驗(yàn)（IFA)和病毒中和試驗(yàn)（VNT)、 RT-PCR-ELISA等。其中，VNT和ELISA兩種方法最為重要，在國(guó)際貿(mào)易中，前者為指定方法， 后者為替代方法。
[0008] VNT雖是敏感特異的檢測(cè)方法，但也存在一些缺點(diǎn)，如⑴費(fèi)時(shí)，一般10~12天才 能獲得結(jié)果。（2)條件嚴(yán)格，涉及細(xì)胞培養(yǎng)和試驗(yàn)樣品的無(wú)菌處理，結(jié)果判定要有經(jīng)驗(yàn)等，在 發(fā)展中國(guó)家，尤其現(xiàn)地基層，沒(méi)有條件開展。（3)費(fèi)力，工作量和勞動(dòng)強(qiáng)度大，不適合大量樣 品的檢測(cè)。ELISA目前建立有間接、競(jìng)爭(zhēng)或阻斷ELISA等多種方法，檢測(cè)用抗原有全病毒抗 原或針對(duì)核衣殼蛋白（N)、血凝素蛋白（H)的重組表達(dá)抗原，它們之間在敏感性和特異性上 存在差異。由于羊血清往往存在背景值偏高的問(wèn)題，因此，基于核衣殼蛋白（N)和血凝素蛋 白（H)的單克隆抗體，建立了競(jìng)爭(zhēng)或阻斷ELISA方法。目前英法兩國(guó)的小反芻獸疫參考實(shí) 驗(yàn)室雖有商品化的ELISA試劑盒面世，但仍存在敏感性和特異性不足的問(wèn)題，尚不能取代 黃金標(biāo)準(zhǔn)的VNT方法，加之使用價(jià)格比較昂貴。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明人基于免疫組織化學(xué)原理，建立了基于免疫過(guò)氧化物酶細(xì)胞單層試驗(yàn) (immunoperoxidase monolayer assay，IPMA)的小反合獸疫病毒抗體檢測(cè)試劑盒，可以用 于檢測(cè)病毒蛋白（細(xì)胞內(nèi)抗原）相應(yīng)的抗體，并且具有敏感特異、簡(jiǎn)便快速、判讀直觀，適合 大量樣品與溯源檢測(cè)的特點(diǎn)。本發(fā)明人建立的基于IPMA檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的試劑 盒和方法，為國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道；同時(shí)，所述試劑盒能夠取代國(guó)外價(jià)格昂貴的ELISA試劑盒， 應(yīng)用于我國(guó)對(duì)小反芻獸疫的防控實(shí)踐中。
[0010] 在第一方面，本發(fā)明提供基于IPMA的小反芻獸疫病毒抗體檢測(cè)試劑盒，所述試劑 盒包括：包含細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性抗原與陰性抗原的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血 清、樣品稀釋液、鹽水洗滌液、HRP標(biāo)記鼠抗羊McAb、二組分AEC顯色液、終止液、血清稀釋板 和使用說(shuō)明書。其中，所述細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性抗原為小反芻獸疫病毒rPPRV/GFP感染的BHK-gSLAM 細(xì)胞，所述細(xì)胞內(nèi)陰性抗原為未感染小反芻獸疫病毒的BHK-gSLAM細(xì)胞。所述陽(yáng)性對(duì)照血 清為小反芻獸疫病毒疫苗株P(guān)PRV N75/1免疫山羊后采血，分離獲得的免疫陽(yáng)性血清，中和 效價(jià)在1 : 160以上。所述陰性對(duì)照血清為小反芻獸疫陰性山羊未經(jīng)免疫直接采血，分離 獲得的陰性血清。優(yōu)選地，其中所述BHK-gSLAM細(xì)胞為保藏號(hào)為CGMCC No. 10587的細(xì)胞。
[0011] 更具體地，其中所述樣品稀釋液為含4%馬血清和0. 5%吐溫80的0. 5M氯化鈉溶 液，pH 7. 2 ;
[0012] 所述鹽水洗滌液為含0. 5 %吐溫80的0. 15M氯化鈉溶液；
[0013] 所述二組分AEC顯色液由A液和B液按1 : 1的體積比組成，其中A液由下述組 成：50mg 3-氨基-9-乙基咔唑，2. 5ml N，N-二甲基甲酰胺和47. 5ml醋酸溶液，pH 5. 0 ;B 液由50ml純水和20 y 1雙氧水組成；
[0014] 所述終止液為0? 05M醋酸溶液，pH 5. 0。
[0015] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的基于IPMA的小反芻獸疫病毒抗體檢測(cè) 試劑盒包括：含細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性抗原與陰性抗原的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，96孔/I塊/盒；陽(yáng)性對(duì)照 血清，100 y 1/1管/盒；陰性對(duì)照血清，100 y 1/1管/盒；樣品稀釋液，30ml/l瓶/盒；鹽水 洗滌液，400ml/l瓶/盒；HRP標(biāo)記鼠抗羊McAb，12ml/l瓶/盒；二組分AEC顯色液（A液： 6ml/l瓶/盒和B液：6ml/l瓶/盒）；終止液，6ml/l瓶/盒；血清稀釋板，96孔/I塊/盒；說(shuō) 明書，1份/盒。其中所述細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性抗原為小反芻獸疫病毒rPPRV/GFP感染的BHK-gSLAM 細(xì)胞，所述細(xì)胞內(nèi)陰性抗原為未感染小反芻獸疫病毒的BHK-gSLAM細(xì)胞（保藏號(hào)為CGMCC No. 10587)。所述陽(yáng)性對(duì)照血清為小反芻獸疫病毒疫苗株P(guān)PRV N75/1免疫山羊后采血，分 離獲得的免疫陽(yáng)性血清，中和效價(jià)在1 : 160以上。所述陰性對(duì)照血清為小反芻獸疫陰性 山羊未經(jīng)免疫直接采血，分離獲得的陰性血清。所述樣品稀釋液為含4%馬血清和0. 5 %吐 溫80的0. 5M氯化鈉溶液，pH 7. 2 ;所述鹽水洗滌液為含0. 5 %吐溫80的0. 15M氯化鈉水 溶液；所述二組分AEC顯色液由A液和B液按1 : 1的體積比組成，其中A液由下述組成： 50mg 3-氨基-9-乙基咔唑，2. 5ml N，N-二甲基甲酰胺和47. 5ml醋酸溶液，pH 5. 0;B液由 50ml純水和20 y 1雙氧水組成；所述終止液為0. 05M醋酸溶液，pH 5. 0。
[0016] 本發(fā)明所述的試劑盒用于小反芻獸疫病毒抗體檢測(cè)或小反芻獸疫疾病診斷的目 的。
[0017] 在第二方面，本發(fā)明提供基于IPMA檢測(cè)小反芻獸疫病毒抗體的方法，所述方法包 括下述步驟：
[0018] 1.細(xì)胞系BHK-gSLAM的建立：用構(gòu)建的重組質(zhì)粒pIRES3-gSLAM轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞 在選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行細(xì)胞克隆，通過(guò)克隆后細(xì)胞的SLAM蛋白表達(dá)檢測(cè)及病毒rPPRV/GFP 感染試驗(yàn)對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定，最終獲得乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系BHK-gSLAM。該細(xì)胞系于2015年 4月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC，地址：北京市朝 陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中科院微生物研宄所，郵政編碼：100101，http ://www.cgmcc. net) 〇
[0019] 2.細(xì)胞內(nèi)抗原的制備：BHK-gSLAM細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)長(zhǎng)成單層后，以接種 rPPRV/GFP病毒的細(xì)胞作為陽(yáng)性抗原，同時(shí)以未接毒的細(xì)胞作為陰性抗原。當(dāng)接毒孔內(nèi)受感 染細(xì)胞達(dá)到15~30%時(shí)，棄去細(xì)胞板內(nèi)生長(zhǎng)培養(yǎng)液，終止細(xì)胞培養(yǎng)。0. 15M鹽水溶液洗滌 細(xì)胞板后，用預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液對(duì)細(xì)胞板室溫下固定10分鐘，棄去固定液。洗板后， 加入3%魚皮膠溶液對(duì)細(xì)胞板37°C封閉2小時(shí)，棄去封閉液。37°C干燥1~2小時(shí)后，將細(xì) 胞板密封，4°C保存或-20°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0020] 3?用法與判定：
[0021] 試劑盒所有試劑組分使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫（18~25°C )，通常室溫放置30min即 可，使用后放回2~8°C。使用過(guò)程中，各組分應(yīng)避免交叉污染；同時(shí)不同批次之間或不同 試劑盒之間的組分不可交叉使用。
[0022] 3. 1樣品處理受試血清樣品800Xg離心5分鐘后，用樣品稀釋液（含4%馬血清 和0.5%吐溫80的0.511氯化鈉溶液4117.2)在96孔稀釋板上按1:10、1:40、1:160 和1 : 640的濃度對(duì)血清樣品進(jìn)行稀釋，待用。
[0023] 3.2 -抗孵育
[0024] 將稀釋好的血清樣品或?qū)φ昭澹?00y1/孔移入上述步驟2中制備好的細(xì)胞 抗原板上，密封后，37°C孵育1小時(shí)。棄去液體，鹽水洗滌液（含0. 5 %吐溫80的0. 15M氯 化鈉溶液）洗滌3次。
[0025] 3.3 二抗孵育
[0026] 按100 y 1/孔加入合適濃度的HRP標(biāo)記鼠抗羊McAb，37°C孵育1小時(shí)。棄去液體，