一種原子力顯微鏡檢測單分子水平分子間相互作用的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種原子力顯微鏡檢測單分子水平分子間相 互作用的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 單分子檢測（single molecular detection，SMD)是近十年來迅速發(fā)展起來的一 項(xiàng)超靈敏檢測技術(shù)。常規(guī)分子檢測技術(shù)僅能得到一般物質(zhì)的整體屬性，無法準(zhǔn)確、有效地表 達(dá)單個(gè)分子及單個(gè)分子之間的相互作用。而很多生物分子（如蛋白質(zhì)、DNA、RNA等）都有 多種構(gòu)象，且分子之間具有相互作用。因此，從單分子水平檢測生物分子，對識別、分類和定 量描述生物分子，實(shí)時(shí)監(jiān)測化學(xué)反應(yīng)途徑，在生理?xiàng)l件下探測生物分子并提供分子結(jié)構(gòu)和 功能之間的信息具有重要意義。
[0003] 單分子檢測是在納米級空間尺度檢測有限個(gè)數(shù)目的分子或分子相互作用的事 件。采用原子力顯微鏡的酶促反應(yīng)可實(shí)現(xiàn)納米或微米精密度下固相載體表面靶分子的可控 固定。酶促納米加工刻蝕技術(shù)可提供酶促反應(yīng)產(chǎn)物隨AFM探針移動而重新沉積時(shí)的形貌 信息。例如，可通過在AFM探針上固定活性酶分子，以除去預(yù)先存在的生物分子或者將其 轉(zhuǎn)化為小分子，得到底片圖像。為實(shí)現(xiàn)高通量和柔性分子印刷，浸蘸筆納米加工刻蝕技術(shù) (dip-pen nanolithography，DPN)和微接觸印刷技術(shù)已應(yīng)用于多元DPN和多聚物筆加工刻 蝕技術(shù)，并可通過原子力顯微鏡或熒光成像可視化。由于這些技術(shù)涉及到納米級操作，因此 需要建立可控方法以實(shí)現(xiàn)單個(gè)分子在基底表面特定位置的固定。原子力顯微鏡技術(shù)可將單 個(gè)分子固定于指定位置，已應(yīng)用于單分子和其他單分子力學(xué)光譜技術(shù)的研宄。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中沒有通過采用原子力顯微鏡直接測量DNA之間的相互作用力，實(shí)現(xiàn)單 分子水平上監(jiān)測DNA雙鏈在切刻內(nèi)切酶作用下發(fā)生的剪切反應(yīng)，該現(xiàn)狀亟待解決。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種原子力顯微鏡用于檢測單分子水平分子間相互作用的 方法，通過采用原子力顯微鏡直接測量DNA之間的相互作用力，實(shí)現(xiàn)了單分子水平上監(jiān)測 DNA雙鏈在切刻內(nèi)切酶作用下發(fā)生的剪切反應(yīng)，為研宄單分子水平上的酶促反應(yīng)提供了一 種新方法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種原子力顯微鏡用于檢測單分子水平分子間相互作用的方法，在基底表面修飾 DNA1和在AFM探針上修飾DNA2 ;當(dāng)AFM探針與基底表面靠近時(shí)，通過DNA1與DNA2的互補(bǔ) 雜交，形成DNA1/DNA2雙鏈結(jié)構(gòu)；采用切刻內(nèi)切酶特異性識別雙鏈DNA1/DNA2中的特定序 列，并將單鏈DNA1切斷；然后采用原子力顯微鏡檢測DNA之間的作用力。
[0008] 包括以下步驟：
[0009] (1) AFM探針修飾DNA2 :將AFM探針進(jìn)行羥基化修飾，得到羥基修飾的AFM探針，然 后活化羥基修飾的AFM探針，將活化后的AFM探針與氨基修飾的DNA2進(jìn)行固定反應(yīng)，取出 AFM探針，對AFM探針進(jìn)行后處理。
[0010] (2)金基底上固定DNA1 :預(yù)處理金基底，將處理好的金基底與巰基修飾的DNA1進(jìn) 行固定反應(yīng)，37°C反應(yīng)3小時(shí)以上。
[0011] ⑶原子力顯微鏡測力：將緩沖溶液3滴在步驟⑵中得到的金基底上，將液滴固 定在原子顯微鏡的掃描器上，測DNA之間的相互作用力F1 ;使用切刻內(nèi)切酶時(shí)，將含有IX 切刻內(nèi)切酶緩沖液、切刻內(nèi)切酶和所述緩沖溶液3的混合溶液，滴加到金基底上，將液滴固 定在原子顯微鏡的掃描器上，測DNA之間的相互作用力F2 ;從而檢測出DNA雙鏈在切刻內(nèi) 切酶剪切前后DNA之間相互作用力的變化。
[0012] 步驟（1)中，所述羥基化修飾的過程為：將AFM探針浸泡在濃硫酸和雙氧水的混合 溶液中（濃硫酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)95~98 % ):雙氧水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)30 % )= 7:3 (體積比））30分 鐘，去離子水洗凈，得到羥基修飾AFM探針。
[0013] 步驟（1)中，所述活化過程為：將羥基修飾的AFM探針浸泡在200 y 1濃度為lOOmM N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)溶液中（注意：NHS溶液現(xiàn)用現(xiàn)配），避光放置30分鐘后，去離子 水沖洗干凈。
[0014] 步驟（1)中，后處理的過程為：先用緩沖溶液2沖洗三次，再用去離子水洗凈，空氣 中干燥30分鐘。所述緩沖液2的組成：300mM NaCl，20mM Na2HP04, 2mM乙二胺四乙酸，7mM 十二烷基硫酸鈉，pH = 7. 4 ;作用：用于清洗AFM探針。
[0015] 步驟（1)中，所述固定反應(yīng)的過程為：將修飾有DNA2的AFM探針浸泡在200 y 1濃 度為1 的氨基修飾DNA2溶液中，25°C反應(yīng)12小時(shí)以上，優(yōu)選為12~24小時(shí)，最優(yōu)選的 為16小時(shí)。
[0016] 步驟（2)中，所述預(yù)處理金基底的過程為：將金基底清洗、干燥。進(jìn)一步具體的過 程為：用清洗液浸泡超聲10分鐘，去離子水沖洗干凈，氮?dú)獯蹈?。所述清洗液為：氨水和雙 氧水的混合溶液，其中水：氨水：雙氧水的體積比為5:1: 1。
[0017] 步驟（2)中，所述固定反應(yīng)過程為：將處理好的金基底浸泡在1ml濃度為1 yM的 疏基修飾DNA1中進(jìn)行固定反應(yīng)。
[0018] 步驟（2)中，所述反應(yīng)時(shí)間為3~24小時(shí)。
[0019] 步驟（3)中，測DNA之間的相互作用力的過程為：將AFM探針放入液相探針架后， 將探針架裝入原子力掃描顯微鏡。打開儀器開關(guān)，調(diào)節(jié)探針架使其下降，與金基底上的液滴 接觸。確保金基底與探針架玻璃片之間無氣泡后，調(diào)節(jié)光斑。選擇接觸模式，進(jìn)針，停駐時(shí) 間：10000ms。開始測量DNA之間的相互作用力，從而檢測出DNA雙鏈在切刻內(nèi)切酶剪切前 后DNA之間相互作用力的變化。
[0020] 步驟（3)中，所述緩沖液 3 組成：20mM Tris-HCl，0. 1M MgCl2, pH = 8. 0,作用：原 子力顯微鏡測力的檢測體系。
[0021] 步驟⑶中，所述切刻內(nèi)切酶是一類識別DNA特異序列，并在識別位點(diǎn)或其周圍 剪切雙鏈DNA底物中的一條DNA鏈的內(nèi)切酶。所述切刻內(nèi)切酶為切刻內(nèi)切酶Nb.BbvCI ;所 述IX切刻內(nèi)切酶Nb. BbvCI緩沖液的組成為醋酸鉀、Tris-醋酸、醋酸鎂和牛血清白蛋白 (BSA)，其中各組分的濃度分別為：50mM醋酸鉀，20mM Tris-醋酸，10mM醋酸鎂，100 y g/ml BSA, pH 7. 9〇
[0022] 所述DNA1和DNA2為兩條堿基互補(bǔ)的待測鏈。
[0023] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明建立了一種原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM)研宄單分子水平上DNA雙鏈在切刻內(nèi)切酶作用下發(fā)生剪切反應(yīng)的方法。 選用金片作為基底，通過Au-S共價(jià)鍵在金基底上固定DNA1，使其與通過酰胺反應(yīng)固定在 AFM探針上的DNA2互補(bǔ)雜交，從而在基底表面形成完全互補(bǔ)雜交的DNA1/DNA2雙鏈結(jié)構(gòu)， 且雙鏈中包含切刻內(nèi)切酶的特異性識別位點(diǎn)。在切刻內(nèi)切酶作用下，固定在金基底上的單 鏈DNA1被切斷為DNA1'和DNA1"，其中DNA1'固定在金基底上。與雙鏈DNA1/DNA2相比，由 于DNA1'與DNA2互補(bǔ)雜交的堿基數(shù)減少，因此DNA相互作用力減小。本發(fā)明通過采用原子 力顯微鏡直接測量DNA之間的相互作用力，實(shí)現(xiàn)了單分子水平上監(jiān)測DNA雙鏈在切刻內(nèi)切 酶作用下發(fā)生的剪切反應(yīng)，為研宄單分子水平上的酶促反應(yīng)提供了一種新方法，并能準(zhǔn)確、 有效地表達(dá)單個(gè)分子及單個(gè)分子之間的相互作用，為揭示生命現(xiàn)象的重要過程提供理論依 據(jù)，在分析化學(xué)、臨床診斷和生物過程動力學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0024] 圖1 :原子力顯微鏡技術(shù)研宄單分子水平上DNA雙鏈在切刻內(nèi)切酶作用下發(fā)生剪 切反應(yīng)的原理圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。
[0026] 本發(fā)明中AFM探針來源于本原納米儀器有限公司（接觸模式），金基底來源于芬蘭 BioNavis公司，DNA1和DNA2來源于生工生物工程（上海）股份有限公司，原子力顯微鏡來 源于本原納米儀器有限公司CSPM5500掃描探針顯微鏡（SPM)系統(tǒng)，其他試劑無特殊說明均 來自商業(yè)途徑。
[0027] 本發(fā)明中 M 表不 mol/L，mM 表不 mmol/L，y M 表不 y mol/L。
[0028] 實(shí)施例1
[0029] 本實(shí)施例選用切刻內(nèi)切酶Nb. BbvCI以研宄單分子水平DNA雙鏈在切刻內(nèi)切酶作 用下發(fā)生的剪切反應(yīng)（實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示）。主要包括以下步驟：
[0030] 一、AFM 探針上修飾 DNA1:
[0031] 1、首先分別配制緩沖溶液1、緩沖溶液2和緩沖溶液3。
[0032] 緩沖溶液 1 組成：25mM NaHC03,5mM MgCl2,10% (v/v)二甲基亞砜，pH = 8. 5。作 用：用于配制DNA溶液。
[0033] 緩沖溶液2組成：300mM NaCl，20mM Na2HP04, 2mM乙二胺四乙酸，7mM十二烷基硫酸 鈉，pH = 7. 4。作用：用