利用dapi嵌入和釋放模擬dna納米折紙結(jié)構(gòu)作為藥物載體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于DNA納米技術(shù)發(fā)展、納米材料功能化及應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種通過DNA滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)以及DNA折紙術(shù)構(gòu)建的DNA納米折紙結(jié)構(gòu)，同時利用有DNA雙鏈結(jié)合特性以及細(xì)胞膜穿透特性的熒光染料DAPI對DNA納米折紙結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實現(xiàn)實時監(jiān)控以及模擬DNA納米折紙復(fù)合結(jié)構(gòu)作為藥物載體的載藥、緩釋過程，也可作為一種新的熒光定量分析方法應(yīng)用于生物分子檢測，如腫瘤的早期檢測、術(shù)后監(jiān)測評估以及細(xì)胞成像等領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，惡性腫瘤已成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人類健康及生命的重大疾病之一。調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，在發(fā)展中國家，癌癥的死亡率在所有疾病的死亡率中位居第二位。世界各國投入大量的人力、物力用于腫瘤的預(yù)防、診斷和治療。近年來快速發(fā)展的納米生物技術(shù)，為目前抗腫瘤藥物載體領(lǐng)域提供了強(qiáng)有力的手段。納米材料作為新一代的藥物載體的研究正蓬勃發(fā)展，它本身能改善藥物的水溶性、提高藥物的穩(wěn)定性以及實現(xiàn)藥物緩慢控制釋放、靶向定位、以及多靶向治療等。目前利用納米顆?；蚣{米結(jié)構(gòu)作為抗腫瘤藥物載體進(jìn)行抗腫瘤的研究中，使用較多的如高分子納米材料、脂質(zhì)體以及金屬納米粒子等，并且已有很多納米藥物運載系統(tǒng)成功應(yīng)用的先例，但不可否認(rèn)的是，在藥物的高效負(fù)載、靶向輸運、集治療和檢測于一體的多功能藥物載體的研究里關(guān)于仍然存在諸多問題，比如脂質(zhì)體的粒徑分布可能影響載體進(jìn)入細(xì)胞的效率，另外一些金屬納米粒子存在生物安全方面的爭議等。因此，近幾年國際上基于DNA納米技術(shù)的DNA納米折紙結(jié)構(gòu)成為新一代的抗腫瘤藥物載體的相關(guān)研究備受矚目。
[0003]DNA折紙術(shù)作為一種精確高效的自組裝技術(shù)，自2006年Rothemund發(fā)明以來在生物醫(yī)藥、高靈敏度檢測、納米光電子器件、等離子體光子學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，近年來受到廣泛關(guān)注。而目前進(jìn)行DNA折紙時，多利用含7249個堿基的噬菌體單鏈M13 DNA作為腳手架鏈，同時需設(shè)計幾百條幾個堿基不等的特定序列單鏈DNA作為訂書釘鏈，然后再通過特定的折紙程序，進(jìn)行不同二維納米結(jié)構(gòu)的組裝。在這過程中，實驗設(shè)計和操作復(fù)雜，訂購試劑耗資昂貴。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種利用DAPI嵌入和釋放模擬DNA納米折紙結(jié)構(gòu)作為藥物載體的方法。
[0005]—種利用DAPI嵌入和釋放模擬DNA納米折紙結(jié)構(gòu)作為藥物載體的方法，其特征在于，通過DNA滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)得到長單鏈DNA作為支架鏈，加入訂書釘鏈后進(jìn)行折紙得到二維DNA納米折紙結(jié)構(gòu)，具備DNA雙鏈強(qiáng)力結(jié)合能力的熒光染料嵌入其中，通過嵌入后熒光強(qiáng)度的增高以及DNA納米折紙復(fù)合結(jié)構(gòu)降解后染料釋放導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降過程監(jiān)控DNA納米折紙結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性并模擬其作為抗腫瘤藥物載體的藥物負(fù)載及緩釋過程。
[0006]所述的DNA滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，環(huán)模板為一堿基數(shù)為96的閉合單鏈DNA，且序列為:5’ -TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCT GACTTC-3’。
[0007]所述的訂書釘鏈共三條，每條都能與長單鏈DNA進(jìn)行互補(bǔ)雜交，且序列分別為，訂書釘鏈 1:5’ -CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’ ；訂書釘鏈 2: CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG ;訂書釘鏈 3: TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT。
[0008]所述的支架鏈加入訂書釘鏈后得到二維DNA納米折紙結(jié)構(gòu)，制備條件是:高溫95°C，三分鐘，后每降0.2°C，持續(xù)20s，直至4°C。
[0009]所述的二維DNA納米折紙結(jié)構(gòu)，長度可達(dá)微米級，寬度為16nm。
[0010]所述的具備DNA雙鏈強(qiáng)結(jié)合能力的熒光染料，嵌入雙鏈之前熒光微弱，而嵌入后則熒光值大大增強(qiáng)，且能穿透細(xì)胞膜的4’，6_ 二脒基-2-苯基吲哚(4，, 6-diamidino-2-phenyI indole, DAPI)0
[0011 ] 所述的DNA納米折紙復(fù)合結(jié)構(gòu)與DAPI形成的復(fù)合結(jié)構(gòu)或通過電紡技術(shù)所得的DNA納米折紙結(jié)構(gòu)膜與DAPI形成的復(fù)合結(jié)構(gòu)。
[0012]本發(fā)明通過DNA滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)使得短鏈DNA延伸成長單鏈DNA，后將其作為腳手架鏈，加入三條訂書釘即可通過DNA折紙術(shù)制備具有一定寬度的DNA納米折紙結(jié)構(gòu)。因此納米折紙結(jié)構(gòu)由雙鏈結(jié)構(gòu)組成，因此可結(jié)合有雙鏈強(qiáng)力嵌入特性的熒光染料DAPI(4，，6-diamidino_2-phenylindole，4’，6- 二脒基 ~2~ 苯基卩引噪)。通過 DAPI 嵌入 DNA 納米折紙結(jié)構(gòu)后熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)以及DNA納米折紙結(jié)構(gòu)降解后釋放DAPI導(dǎo)致的熒光強(qiáng)度下降模擬DNA納米折紙結(jié)構(gòu)作為抗腫瘤藥物載體的藥物負(fù)載及緩釋過程。
【附圖說明】
[0013]圖1:不同濃度DAPI溶液中加入與不加入DNA納米折紙結(jié)構(gòu)兩組熒光值高低比較結(jié)果。由結(jié)果可以看出，加入DNA納米折紙結(jié)構(gòu)的實驗組熒光值有明顯的增強(qiáng)。
【具體實施方式】
[0014]實施例1:
16 μ L 引物 DNA (I μ Μ，序列為 5’ CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3，)中依次加入 12 μ L 環(huán) DNA(2 μΜ，序列為:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L，10 mM)，RCA buffer (4 μ L，10Χ)，phi29 polymerase 4 μ L，10 U/μ L)，混合溶液終體積為 40 μ L。然后 30° C 水浴中擴(kuò)增30 mino所得產(chǎn)物40 μ L經(jīng)過10%PAGE電泳，后割膠回收，去除小片段DNA及多余的環(huán)DNA及引物DNA。取回收所得產(chǎn)物3 μ LdPAmilliQA 12 μ L，加入訂書鏈1-3(100 μ Μ，序列依次為:
5 ’ -CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’
5 ’ -CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’
5’ -TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’)各 I μ L，2 μ L TAE 緩沖液(10 X，125mMMg2+)，總體積為20 μ L，溶液充分混合均勻后置入高溫95° C后梯度降溫至25° C。1yL產(chǎn)物稀釋到90 μ LMill1-Q水中，取5 yL滴到平整清潔云母表面，吸附3min后，Mill1-Q滴流沖洗，原子力顯微鏡Tapping-mode成像。
[0015]實施例2:
16 μ L 引物 DNA (I μ Μ，序列為 5’ CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3，)中依次加入 12 μ L 環(huán) DNA(2 μΜ，序列為:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L，10 mM)，RCA buffer (4 μ L，10Χ)，phi29 polymerase 4 μ L，10 U/μ L)，混合溶液終體積為 40 μ L。然后 30° C 水浴中擴(kuò)增30 mino所得產(chǎn)物40 μ L經(jīng)過10%PAGE電泳，后割膠回收，去除小片段DNA及多余的環(huán)DNA及引物DNA。取回收所得產(chǎn)物3 yL，加入milliQ水12 yL，加入訂書鏈1-3 (I μΜ,序列依次為:
5 ’ CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC3’
5 ’ CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG3’
5 ’ TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT3，，各 I μ L，2 μ L TAE 緩沖液(10 X，125mMMg2+)，總體積為20 μ L，溶液充分混合均勻后置入高溫95° C后梯度降溫至25° C。取10 μ L制備的DNA納米折紙結(jié)構(gòu)，加入10 μ L 0.5mg/mL DAPI溶液后室溫下反應(yīng)1min后加入80 μ LmiIIiQ水后混合均勻，使用熒光分光光度計(激發(fā)波長/發(fā)射波長:364nm/454nm)測試其熒光強(qiáng)度；同時取20 μ L 0.5mg/mL DAPI溶液后并加入80 μ LmilliQ水后混合均勻，使用熒光分光光度計(激發(fā)波長/發(fā)射波長:340nm/488nm )測試溶液熒光強(qiáng)度，比較兩組熒光強(qiáng)度大小判斷DAPI嵌入DNA納米折紙結(jié)構(gòu)后熒光增強(qiáng)效果。
[0016]實施例3:
16 μ L 引物 DNA (I μ Μ，序列為 5’ CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3，)中依次加入 12 μ L 環(huán) DNA(2 μΜ，序列為:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L，10 mM)，RCA buffer (4 μ L，10Χ)，phi29 polymerase 4 μ L，10 U/μ L)，混合溶液終體積為 40 μ L。然后 30° C 水浴中擴(kuò)增30 mino所得產(chǎn)物40 μ L經(jīng)過10%PAGE電泳，后割膠回收，去除小片段DNA及多余的環(huán)DNA及引物DNA。取回收所得產(chǎn)物3 yL，加入milliQ水12 yL，加入訂書鏈1-3 (I μΜ,序列依次為:
5 ’ CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC3’
5 ’ CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG3’
5 ’ TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT3，，各 I μ L，2