一種慶大霉素殘留檢測試紙條及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種慶大霉素殘留檢測試紙條及其應用，具體涉及一種用于檢測牛奶 中慶大霉素殘留的試紙條。
【背景技術】
[0002] 慶大霉素（Gentamicin，GM)屬于氨基糖甙類抗生素，主要作用于革蘭氏陰性細 菌，由于其具有廣譜抑菌和殺菌作用，被廣泛應用于獸醫(yī)臨床和動物飼料添加劑。但GM的 血清有效濃度與毒性濃度很相近，安全范圍較小，在其應用過程中易產(chǎn)生毒副作用，尤其大 劑量不規(guī)范使用，易導致動物性食品中GM殘留超標.對人體健康構成危害，造成腎毒性和 耳毒性。許多國家在動物生產(chǎn)中嚴禁使用GM或規(guī)定有嚴格的最高殘留限量（MRL)，我國農(nóng) 業(yè)部235號公告規(guī)定，動物性食品中GM的MRL為100ng/g。
[0003]目前慶大霉素殘留檢測方法主要有氣相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-串 聯(lián)質(zhì)譜法、高效毛細管電泳法和免疫學檢測法。儀器法檢測價格昂貴，不適合在基層推廣使 用和大量篩選。免疫學測定方法靈敏度較高，特異性強，使用方便。因此，大規(guī)模篩選檢測 以免疫學檢測方法更實際、更具有應用前景。膠體金免疫層析法檢測時間短，穩(wěn)定性好、操 作簡便、無需其他儀器設備，結果判斷直觀可靠，適用于進行現(xiàn)場快速篩選。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供一種慶大霉素殘留檢測試紙條及其應用。
[0005] 本發(fā)明所提供的慶大霉素殘留檢測試紙條包括試紙和微孔試劑，試紙包括反應 膜、樣品吸收墊、吸水墊、保護膜、底板；反應膜上包括檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測區(qū)包被有慶大 霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被有羊抗鼠抗抗體。所述微孔試劑中凍干有慶大 霉素單克隆抗體-膠體金標記物，微孔試劑具有微孔塞。
[0006] 所述慶大霉素半抗原_載體蛋白偶聯(lián)物是由慶大霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得 至IJ，所述載體蛋白可為卵清蛋白、牛血清白蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白、血藍蛋白。
[0007] 所述慶大霉素單克隆抗體-膠體金標記物中的慶大霉素單克隆抗體是以慶大霉 素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備獲得的慶大霉素單克隆抗體。
[0008] 所述保護膜粘貼在樣品吸收墊上，為檢測端，上面有MAX標記線。
[0009]所述檢測區(qū)位于近于有MAX標記的保護膜的一端，所述質(zhì)控區(qū)位于遠離有MAX標 記的保護膜的一端，均呈與所述試紙的長相垂直的條帶狀。
[0010] 所述底板為PVC底板；所述樣品吸收墊為吸濾紙；所述吸水墊為吸水紙；所述反應 膜為硝酸纖維素膜；所述保護膜為PE材質(zhì)保護膜。
[0011] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備上述慶大霉素殘留檢測試紙條的方法，其包 括步驟：
[0012] 1)制備凍干有慶大霉素單克隆抗體-膠體金標記物的微孔試劑；
[0013] 2)制備具有包被慶大霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測區(qū)和包被羊抗鼠抗抗 體的質(zhì)控區(qū)的反應膜；
[0014] 3)將2)制備好的反應膜與樣品吸收墊、吸水墊、保護膜、底板組裝成試紙；
[0015] 4)將1)和3)制備好的凍干有慶大霉素單克隆抗體-膠體金標記物的微孔試劑和 試紙組裝成試紙條。
[0016] 具體地說，步驟包括：
[0017] 1)將慶大霉素與對溴甲基苯甲酸反應，制備慶大霉素半抗原；
[0018] 2)將慶大霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，制備慶大霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物；
[0019] 3)用慶大霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物免疫小鼠，將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細 胞通過融合、篩選，得到分泌慶大霉素單克隆抗體的雜交瘤細胞株；
[0020] 4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗體；
[0021] 5)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應制備膠體金；
[0022] 6)將制備的慶大霉素單克隆抗體加入到制備的膠體金中，得到慶大霉素單克隆抗 體-膠體金標記物；
[0023] 7)將慶大霉素單克隆抗體-膠體金標記物凍干在微孔試劑中后，將微孔試劑加上 微孔塞；
[0024] 8)將樣品吸收墊用含牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在緩沖液中的終濃度為0. 5% 體積百分含量）、pH為7. 2、0.lmol/L磷酸鹽緩沖液浸泡2h，37°C下烘干2h;
[0025] 9)在底板上按順序粘貼上樣品吸收墊、反應膜、吸水墊和保護膜；
[0026] 10)將制備好的微孔試劑、試紙組裝成試紙條，2~8°C條件下保存12個月。
[0027] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種應用上述慶大霉素殘留檢測試紙條檢測樣品中 慶大霉素殘留的方法，它包括步驟：
[0028] (1)用試紙條進行檢測；
[0029] (2)分析檢測結果。
[0030] 本發(fā)明中用試紙條檢測樣品時，將待檢樣品溶液滴加于微孔試劑中，混勻后室溫 僻育5min，將標有MAX標記線端向下，插入僻育后的微孔試劑，待檢樣品液與微孔中的金 標抗體結合后一起向反應膜擴散；若待檢樣品液中慶大霉素的含量高，則擴散過程中待檢 樣品液中的慶大霉素可與金標抗體相結合，進而完全封閉金標抗體上慶大霉素的抗原結合 點，阻止金標抗體與反應膜上慶大霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物結合，檢測區(qū)不顯色，而抗 抗體則可與金標抗體結合，質(zhì)控區(qū)顯色；若待檢樣品液中慶大霉素的含量低或無，則金標抗 體上的抗原結合位點不能被封閉，進而金標抗體會與反應膜上慶大霉素半抗原-載體蛋白 偶聯(lián)物結合，檢測區(qū)顯色，同時抗抗體也可與金標抗體結合，質(zhì)控區(qū)顯色。如果質(zhì)控區(qū)不顯 色，則試紙失效。如圖48、413、4(3、4(1所示。
[0031] 陽性：當質(zhì)控區(qū)（C)顯示出條帶，而檢測區(qū)⑴不顯色，判為陽性，用" + "表示。
[0032] 陰性：當質(zhì)控區(qū)（C)和檢測區(qū)⑴均顯示出條帶，判為陰性，用"一"表示。
[0033] 無效：當質(zhì)控區(qū)（C)不顯示條帶，試紙失效。
[0034] 本發(fā)明采用將高特異性的慶大霉素單克隆抗體-膠體金標記物凍干在微孔試劑 中，能夠使金標抗體與待檢樣品液充分接觸，充分反應，從而減少誤差，增加整個體系的反 應靈敏度。本發(fā)明的試紙條具有靈敏度高、成本低、操作簡單、檢測時間短、儲存簡單、保質(zhì) 期長的優(yōu)點。用本發(fā)明的試紙條檢測慶大霉素，方法簡單、快速、直觀、準確、成本低、易推廣 使用。
【附圖說明】
[0035] 圖1為試紙剖面結構示意圖。
[0036] 圖2為試紙俯視圖。
[0037] 圖3為微孔試劑圖。
[0038] 圖4a、4b、4c、4d為試紙檢測結果判定圖。
[0039] 圖5為慶大霉素半抗原合成路線圖。
[0040] 圖6為慶大霉素半抗原核磁共振氫譜圖。
【具體實施方式】
[0041] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0042] 實施例1慶大霉素殘留檢測試紙條的構成
[0043] 一、試紙（圖1)
[0044] 所述試紙是由底板、樣品吸收墊、反應膜、吸水墊、保護膜組成；
[0045] 所述樣品吸收墊1、反應膜2、吸水墊3和保護膜7依次按順序粘貼在底板6上，樣 品吸收墊的末端與反應膜相連，反應膜的末端與吸水墊相連，樣品吸收墊的始端與底板的 始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊；
[0046] 所述試紙的樣品吸收墊端粘貼有保護膜，保護膜7覆蓋在樣品吸收墊上的檢測 端，在檢測端保護膜上印有MAX字樣（圖2);
[0047] 所述反應膜上有檢測區(qū)4和質(zhì)控區(qū)5,均呈與所述試紙的長相垂直的條帶狀，檢測 區(qū)位于近于有MAX標記的保護膜的一端，質(zhì)控區(qū)位于遠離有MAX標記的保護膜的一端。檢 測區(qū)包被有慶大霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物（慶大霉素半抗原-卵清蛋白的偶聯(lián)物），質(zhì) 控區(qū)包被有羊抗鼠抗抗體；
[0048] 所述底板為PVC底板；所述樣品吸收墊為吸濾紙；所述吸水墊為吸水紙；所述反應 膜為硝酸纖維素膜；所述保護膜為PE材質(zhì)保護膜。
[0049] 二、微孔試劑（圖3)
[0050] 所述微孔試劑8具有微孔塞9,微孔試劑中凍干有慶大霉素單克隆抗體-膠體金標 記物。
[0051] 將上述試紙、微孔試劑組裝成試紙條，在2~8°C環(huán)境中保存，有效期12個月。
[0052] 實施例2實施例1中所述的慶大霉素殘留檢測試紙條的制備方法
[0053]-、試紙條的制備
[0054] 試紙條的制備方法主要包括以下步驟：
[0055]1)制備凍干有慶大霉素單克隆抗體-膠體金標記物的微孔試劑；
[0056] 2)制備具有包被慶大霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測區(qū)和包被羊抗鼠抗抗 體的質(zhì)控區(qū)的反應膜；
[0057] 3)將2)制備好的反應膜與樣品吸收墊、吸水墊、保護膜、底板組裝成試紙；
[0058] 4)將1)和3)制備好的凍干有慶大霉素單克隆抗體-膠體金標記物的微孔試劑和 試紙組裝成試紙條。
[0059]下面分步詳細敘述：
[0060](一）各部件的制備
[0061] 1.慶大霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的合成與鑒定
[0062] (1)慶大霉素半抗原的合成和鑒定
[0063] 半抗原的合成（合成路線如圖5)
[0064] 在100mL兩口燒瓶中加入0. 5g對溴甲基苯甲酸及1. 05g慶大霉素和10mL乙醇， 攪拌至溶解，加熱至45°C反應6小時后，減壓蒸除溶劑。乙醇-水體系中重結晶得到對羧芐 基慶大霉素，得到半抗原產(chǎn)物。
[0065]半抗原的鑒定
[0066] 取上述產(chǎn)物經(jīng)核磁共振氫譜測定，如圖6所示，11.Oppm的羧基信號峰、7. 44ppm及 8. 09ppm的芳環(huán)信號峰，說明半抗原合成成功。
[0067] (2)免疫原的制備
[0068] 取14mg慶大霉素半抗原用lmLN,N-二甲基甲酰胺（DMF)溶解，各取30mg碳化 二亞胺（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)用0.2mL水充分溶解后加入上述溶液中，室 溫下攪拌24h，即可得到反應液A;稱取牛血清白蛋白（BSA) 50mg，使之充分溶解在3.8mL PBS(pH7. 2)溶液中，將反應液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h;用 0.Olmol/LPBS溶液在4°C透析3d，每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質(zhì)；分裝， 于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0069] (3)包被原的制備
[0070] 將BSA換成卵清蛋白（0VA)按上述（2)的步驟制備得到慶大霉素包被原。
[0071] 2.慶大霉素單克隆抗體的制備
[0072] ⑴動物免疫
[0073] 將步驟1得到的免疫原注入Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150iig/只，使其產(chǎn)生 抗血清。
[0074] (2)細胞融合和克隆化
[0075] 取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按8:1(數(shù)量配比）比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩 選得到穩(wěn)定分泌慶大霉素單克隆抗體的慶大霉素單克隆抗體雜交瘤細胞株。
[0076] (3)細胞凍存和復蘇
[0077] 將雜交瘤