綴合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種綴合物及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 梅毒（syphilis)又稱為"霉瘡"、"廣瘡"、"棉花瘡"或"楊梅瘡"，是一種慢性系統(tǒng) 性傳染病，被列為世界三大慢性傳染病之一。梅毒病原體是梅毒螺旋體，亦稱蒼白螺旋體 (Treponemapallidum,TP)，由德國的霍夫曼和謝文定在1905年首次發(fā)現(xiàn)。梅毒主要通過性 接觸和血液傳播，而婦女懷孕時(shí)如果感染梅毒，會經(jīng)由胎盤傳染給胎兒，造成先天性梅毒。 梅毒可產(chǎn)生多種多樣的癥狀和體征，早期侵犯生殖器和皮膚，晚期侵犯全身各器官，尤其是 心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，且時(shí)隱時(shí)顯，病程可持續(xù)很長，是僅次于艾滋病的嚴(yán)重危害我國人 民身體健康的性傳播疾病。據(jù)報(bào)道全世界每年約有一千二百萬例新感染病例，近年來梅毒 發(fā)病率在我國也有上升的趨勢，據(jù)2014年梅毒重點(diǎn)疫情報(bào)告，2009年以來梅毒位于乙類傳 染病報(bào)告發(fā)病數(shù)的第三，尤其是在產(chǎn)前門診篩查出的梅毒抗體陽性的孕婦顯著增加，給我 國的公共衛(wèi)生帶來危害。但要確實(shí)證明感染梅毒并不容易，因?yàn)楦腥驹缙诓o臨床癥狀，潛 伏期在10天至90天，只能靠檢測梅毒血清來幫助診斷，目前病人血清中的標(biāo)志物主要是檢 測梅毒螺旋體（TP)抗體。
[0003] 目前，國內(nèi)外對梅毒的發(fā)病機(jī)制和診斷方式進(jìn)行了大量的研究，梅毒的實(shí)驗(yàn)室診 斷主要包括：病原學(xué)診斷、組織病理學(xué)診斷、基因診斷、腦脊液檢查及血清學(xué)診斷，前四種診 斷方法易受條件制約、臨床較少開展。血清學(xué)診斷根據(jù)使用抗原不同分為兩類：非梅毒螺旋 體抗原血清學(xué)實(shí)驗(yàn)（非特異性TP抗體）和梅毒螺旋體抗原血清學(xué)實(shí)驗(yàn)（特異性梅毒抗體）， 非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)方法主要包括快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR)、不加熱 血清反應(yīng)素試驗(yàn)（USR)、研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)（VDRL)及甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST)，非梅 毒螺旋體抗原血清學(xué)實(shí)驗(yàn)的主要缺點(diǎn)是敏感性和特異性不高，許多非梅毒性疾病，包括類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性迀延性肝炎等均可呈陽性反應(yīng)。梅毒螺旋體抗原血清 學(xué)試驗(yàn)主要包括：梅毒螺旋體顆粒凝集實(shí)驗(yàn)（TPPA)、梅毒螺旋體血球凝集實(shí)驗(yàn)（TPHA)、熒 光螺旋體抗體吸收試驗(yàn)（FTA-ABS)、快速免疫層析試驗(yàn)（RT)、免疫印跡試驗(yàn)（WB)及酶聯(lián)免 疫吸附試驗(yàn)（ELISA)，其中TPPA、TPHA、FTA-ABS、RT、WB試驗(yàn)雖然可提高檢測的特異性，但有 的需制備大量病原體，有的檢測成本較高、操作繁瑣，且質(zhì)量難以控制，不利于大規(guī)模的血 液篩查工作。因此，研制快速、簡便、靈敏且特異的TP體外診斷試劑是當(dāng)前的主要任務(wù)。
[0004] 80年代初，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是基因工程（DNA重組）技術(shù)的出現(xiàn) 使梅毒螺旋體的研究進(jìn)入一個(gè)新的階段。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)檢測方法應(yīng)用免疫學(xué) 技術(shù)測定標(biāo)本，通過抗原抗體反應(yīng)檢測體液中的抗體或抗原性物質(zhì)，是一種敏感的測定的 方法。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)主要采用雙抗原夾心法檢測梅毒抗體，將檢測試劑中的抗原用可 微量測定的物質(zhì)加以標(biāo)記，通過標(biāo)記物將信號放大，得出最終的判定結(jié)果。然而檢測試劑中 的抗原活性位點(diǎn)容易被標(biāo)記物包裹，抗原活性位點(diǎn)被包埋將導(dǎo)致抗原活性降低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于此，有必要提供一種抗原活性位點(diǎn)不容易被標(biāo)記物包裹的綴合物，以及其制 備方法和應(yīng)用。
[0006] -種綴合物，包括突變型梅毒檢測抗原和標(biāo)記物，所述突變型梅毒檢測抗原由梅 毒螺旋體抗原中間的1或2個(gè)賴氨酸突變后得到，所述標(biāo)記物標(biāo)記在所述突變型梅毒檢測 抗原的N端或C端的賴氨酸位點(diǎn)。
[0007] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述突變型梅毒檢測抗原由梅毒螺旋體抗原中間的1或2個(gè)賴 氨酸突變?yōu)楦拾彼岷蟮玫健?br>[0008] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述突變型梅毒檢測抗原包括：
[0009] (a)、由SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸編碼得到的多肽；
[0010] (b)、與SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸具有至少98%同源性的多 核苷酸編碼得到的多肽；或
[0011] (C)、由SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸，其中一個(gè)或多個(gè)堿基被 缺失、替代或增加得到的多核苷酸編碼得到的多肽。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述標(biāo)記物為酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光物質(zhì)、放射性物質(zhì)和膠體 中的至少一種。
[0013] -種上述綴合物的制備方法，包括如下步驟：
[0014] 步驟一、提供用于表達(dá)突變型梅毒檢測抗原的基因表達(dá)序列，所述突變型梅毒檢 測抗原由梅毒螺旋體抗原中間的1或2個(gè)賴氨酸突變后得到；
[0015] 步驟二、將所述基因表達(dá)序列連接到基因表達(dá)載體中；
[0016] 步驟三、將所述基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞；
[0017] 步驟四、對轉(zhuǎn)化了所述基因表達(dá)載體的所述宿主細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分離得到表 達(dá)液；
[0018] 步驟五、在所述表達(dá)液中加入飽和硫酸銨至硫酸銨的終濃度為20%，充分靜止后 收集上清，接著在所述上清中加入飽和硫酸銨至硫酸銨的終濃度為35%，充分靜止后收集 沉淀，將所述沉淀重新溶解，得到粗產(chǎn)物；
[0019] 步驟六、利用Ni-NTA親和柱純化所述粗產(chǎn)物，得到所述突變型梅毒檢測抗原；以 及
[0020] 步驟七、對所述突變型梅毒檢測抗原進(jìn)行標(biāo)記，使得所述標(biāo)記物標(biāo)記在所述突變 型梅毒檢測抗原的N端或C端的賴氨酸位點(diǎn)，得到所述綴合物。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述突變型梅毒檢測抗原由梅毒螺旋體抗原中間的1或2個(gè)賴 氨酸突變?yōu)楦拾彼岷蟮玫健?br>[0022] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述用于表達(dá)突變型梅毒檢測抗原的基因表達(dá)序列包括：
[0023] (a)、SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列；
[0024] (b)、與SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列具有至少98%同源性的核苷酸序列；或
[0025] (c)、SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列，其中一個(gè)或多個(gè)堿基被缺失、替代或增加得 到的核苷酸序列。
[0026] -種梅毒檢測試劑，包括上述的綴合物。
[0027] -種梅毒檢測試劑盒，包括上述的梅毒檢測試劑。
[0028] 在一個(gè)實(shí)施例中，還包括包被抗原包被的酶聯(lián)板、洗滌液、顯色液、終止液、樣品稀 釋液、陰性對照品和陽性標(biāo)準(zhǔn)品；
[0029] 所述包被抗原包括：
[0030](a)、由SEQIDNo. 2所示的核苷酸序列組成的多核苷酸編碼得到的多肽；
[0031] (b)、與SEQIDNo. 2所示的核苷酸序列組成的多核苷酸具有至少98%同源性的多 核苷酸編碼得到的多肽；或
[0032] (c)、由SEQIDNo. 2所示的核苷酸序列組成的多核苷酸，其中一個(gè)或多個(gè)堿基被 缺失、替代或增加得到的多核苷酸編碼得到的多肽。
[0033] 這種綴合物，包括突變型梅毒檢測抗原和標(biāo)記物，通過對梅毒檢測抗原基因突變， 使梅毒檢測抗原中間的1或2個(gè)賴氨酸突變，梅毒檢測抗原中間容易與標(biāo)記物結(jié)合的賴氨 酸變成其它的氨基酸，使得標(biāo)記物標(biāo)記在突變型梅毒檢測抗原的N端或C端的賴氨酸位點(diǎn)， 而不與中間部分的氨基酸結(jié)合，從而避免了抗原活性位點(diǎn)被標(biāo)記物包裹。與傳統(tǒng)的試劑相 比，該綴合物的抗原活性位點(diǎn)不會被標(biāo)記物包裹，避免了抗原決定簇與標(biāo)記物結(jié)合造成的 抗原活性降低，從而不影響抗原活性，該綴合物用于梅毒檢測時(shí)，可提高檢測的靈敏度和特 異性，并且可以避免前帶現(xiàn)象。
【附圖說明】
[0034] 圖1為一實(shí)施方式的綴合物的制備方法的流程圖；
[0035] 圖2為實(shí)施例3中突變型梅毒檢測抗原重組質(zhì)粒的制備過程的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面主要結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對綴合物及其制備方法和應(yīng)用做進(jìn)一步的解釋 說明。
[0037] 本發(fā)明中使用的術(shù)語除非另有說明，否則具有以下含義：
[0038] 綴合物
[0039] 本發(fā)明中使用的術(shù)語"綴合物"包括突變型梅毒檢測抗原和標(biāo)記物，突變型梅毒檢 測抗原中間的一個(gè)或多個(gè)賴氨酸被突變，標(biāo)記物標(biāo)記在突變型梅毒檢測抗原的N端或C端 的賴氨酸位點(diǎn)。
[0040] 標(biāo)記物
[0041] 本發(fā)明中使用的術(shù)語"標(biāo)記物"是指免疫檢測中可被檢測到的物質(zhì)，具體的，標(biāo)記 物可以為酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、膠體中的至少一種。
[0042] 在傳統(tǒng)的免疫檢測時(shí)，標(biāo)記物為酶、發(fā)光物質(zhì)、放射性物質(zhì)等小標(biāo)記物時(shí)，檢測抗 原容易被標(biāo)記物包裹，經(jīng)常發(fā)生抗原表位被包埋而導(dǎo)致抗原活性降低。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，通過基 因突變，使梅毒檢測抗原中間的一個(gè)或多個(gè)賴氨酸發(fā)生改變，可使得標(biāo)記物標(biāo)記在抗原的N 端和C端的賴氨酸位點(diǎn)，而不與中間部分的氨基酸結(jié)合，可以有效的解決上述問題。
[0043] 因此，本發(fā)明提供一種綴合物，包括突變型梅毒檢測抗原和標(biāo)記物，其中，突變型 梅毒檢測抗原由梅毒螺旋體抗原中間的1或2個(gè)賴氨酸突變后得到，標(biāo)記物標(biāo)記在突變型 梅毒檢測抗原的N端或C端的賴氣酸位點(diǎn)。
[0044] 梅毒檢測抗原由梅毒螺旋體抗原中間的1或2個(gè)賴氨酸突變后得到，容易與標(biāo)記 物結(jié)合的賴氨酸變成其它的氨基酸，使得標(biāo)記物標(biāo)記在突變型梅毒檢測抗原的N端或C端 的賴氨酸位點(diǎn)，而不與中間部分的氨基酸結(jié)合，從而避免了抗原活性位點(diǎn)被標(biāo)記物包裹，進(jìn) 而提高檢測的靈敏度和特異性。
[0045] 具體的，突變型梅毒檢測抗原由梅毒螺旋體抗原中間的1或2個(gè)賴氨酸突變成甘 氨酸或其他中性氨基酸后得到。
[0046] 在一個(gè)實(shí)施方式中，突變型梅毒螺旋體抗原由梅毒螺旋體抗原TpNl5的第69位賴 氨酸和第89位賴氨酸突變成甘氨酸得到。突變型梅毒螺旋體抗原采用如下操作制得：PCR 擴(kuò)增梅毒螺旋體抗原15Kda(TpN15)基因（GeneBankNo:U73115. 1)的24aa~140aa所對 應(yīng)的DNA區(qū)段。采用片段褡褳的方式用兩對點(diǎn)突變引物分別突變其中第69位賴氨酸及第 89位賴氨酸，上游引物帶有BamHI位點(diǎn)，下游引物帶有EcoRI位點(diǎn)，用BamHI/EcoRI酶切PCR 回收片段，連接到用BamHI和EcoRI雙酶切處理之后的表達(dá)載體pET-26b(+)中，轉(zhuǎn)化后表 達(dá)的蛋白命名為TP049,即突變型梅毒螺旋體抗原。TP049即為由SEQIDNo. 1所示的核苷 酸序列組成的多核苷酸編