一種人嗜鉻蛋白a的免疫測定法及測定試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是涉及一種人嗜鉻蛋白A的免疫測 定法及測定試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 人嗜絡(luò)粒蛋白A(ChromograninA，CgA)是一種由439個氨基酸組成的酸性可溶 性蛋白，為嗜鉻蛋白家族的主要成員。其廣泛存在于神經(jīng)內(nèi)泌細(xì)胞中，血漿中CgA濃度的升 高可提示神經(jīng)內(nèi)分泌來源的腫瘤。神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤起源于神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，典型的神經(jīng)內(nèi) 分泌腫瘤是類癌瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)腺瘤、垂體 瘤和胰島瘤，并包括MEN1和MEN2綜合征。這還包括不同的神經(jīng)內(nèi)分泌瘤綜合征，即胃泌素 瘤、胰島素瘤、胰高血糖素瘤、生長抑素瘤、產(chǎn)胰多肽瘤和無功能性神經(jīng)內(nèi)分泌瘤等。
[0003] 幾乎所有類型的神經(jīng)內(nèi)泌腫瘤的診斷中都會出現(xiàn)CgA水平的升高，因此，在神經(jīng) 內(nèi)泌腫瘤的診斷中，CgA是極具價值的診斷標(biāo)志物。若以32. 7U/L作為臨界值，CgA對胰腺 腫瘤的靈敏度和特異性分別為82. 1%和96. 2%，對嗜鉻細(xì)胞瘤的靈敏度和特異性分別為 88. 5%和96. 2%。因此，CgA的定量檢測對于胰腺癌及嗜鉻細(xì)胞癌的臨床診斷具有十分重 要的意義。
[0004] 目前，對CgA的測定報道的方法主要有酶聯(lián)免疫分析法（ELISA)、免疫放射分析 法（IRMA)及化學(xué)發(fā)光分析法等。US4758522的專利中涉及一種基于競爭分析法，使用標(biāo) 記的CGA和針對CGA的抗體來測量樣品中CGA含量的方法。測定與抗體結(jié)合或未結(jié)合的 標(biāo)記CGA的量作為樣品中CGA的度量。CGA樣品可以得自內(nèi)分泌腺或腎上腺來源的組織。 EP1078266B1的專利中涉及了一種CGA的免疫測定法，該方法包括將待測定嗜鉻蛋白A含 量的樣品與一組抗體反應(yīng)，其中至少一種（單克隆或多克?。┛贵w與CGA氨基酸序列中的 第145-234位的表位特異性結(jié)合。更具體地，其中至少一種（單克隆或多克?。┛贵w與CGA 氨基酸序列中的第145-197位和/或與第219-234位的表位特異性結(jié)合。上述這兩種抗 體的任一種都可以在CGA測定法中與特異性結(jié)合CGA的250-301位序列中表位的抗體相 組合。專利號為CN102869681A的發(fā)明專利中公開了一種嗜鉻粒蛋白A的免疫測定法，該 CGA多肽的測定方法，主要包括將準(zhǔn)備測定CGA多肽的存在或CGA多肽的量的樣品與一組單 克隆抗體反應(yīng)，其中至少一種單克隆抗體CGA氨基酸序列的第236-251位氨基酸序列表示 的CGA多肽中的表位有反應(yīng)性；并且其中至少一種其他單克隆抗體與CGA氨基酸序列的第 264-279位氨基酸序列表示的CGA多肽中的表位有反應(yīng)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種特異性高、片段存在穩(wěn)定性好、檢 測準(zhǔn)確度高的人嗜鉻蛋白A的免疫測定方法及測定試劑盒。
[0006] 本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種人嗜鉻蛋白A的免疫測定法，所 述的免疫測定法包括將待測定人嗜鉻蛋白A含量的樣品與一組抗體反應(yīng)；其中至少一種抗 體與人嗜鉻蛋白A氨基酸序列中的第1~113位氨基酸的表位特異性結(jié)合；其中至少一種 抗體與人嗜鉻蛋白A氨基酸序列中的第124~143位氨基酸的表位特異性結(jié)合；其中至少 一種抗體與人嗜鉻蛋白A氨基酸序列中的第322~364位氨基酸的表位特異性結(jié)合；其中 至少一種抗體與人嗜鉻蛋白A氨基酸序列中的第373~439位氨基酸的表位特異性結(jié)合； 上述與人嗜鉻蛋白A氨基酸序列中的第1~113位、第124~143位、第322~364位或第 373~439位氨基酸的表位特異性結(jié)合的抗體中，其中至少一種為捕捉抗體；上述與人嗜鉻 蛋白A氨基酸序列中的第1~113位、第124~143位、第322~364位或第373~439位 氨基酸的表位特異性結(jié)合的抗體中，其中至少一種抗體為示蹤抗體。
[0007] 所述的抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
[0008] 所述的捕捉抗體為生物素標(biāo)記的抗體或者直接固定于固定相上，所述的固定相為 微孔板或磁珠。
[0009] 所述的測定方法原理為雙抗體夾心法、免疫比濁法或乳膠增強(qiáng)免疫比濁法。
[0010] 所述示蹤抗體采用的標(biāo)記方法為酶標(biāo)記法或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記法。
[0011] -種人嗜鉻蛋白A的測定試劑盒，所述的測定試劑盒中包含了上述示蹤抗體和捕 捉抗體。
[0012] 所述的測定試劑盒主要包括如下組分：嗜鉻蛋白A抗體包被的微孔板、嗜鉻蛋白A 示蹤抗體、ELISA濃縮洗滌液、ELISAHRP基質(zhì)、ELISA終止液、檢測緩沖液、嗜鉻蛋白A校準(zhǔn) 品以及嗜鉻蛋白A質(zhì)控品；所述的嗜鉻蛋白A校準(zhǔn)品和嗜鉻蛋白A質(zhì)控品均為凍干粉狀態(tài) 的嗜鉻蛋白A抗原。
[0013] 進(jìn)一步地，所述嗜鉻蛋白A示蹤抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的嗜鉻蛋白A抗體； 所述ELISA濃縮洗滌液的主要成分為磷酸鹽；所述ELISAHRP基質(zhì)的主要成分為3, 3 '，5， -四甲基聯(lián)苯胺；所述ELISA終止液的主要成分為0. 5M的硫酸；所述檢測緩沖液的主要 成分為磷酸鹽和牛血清白蛋白。
[0014] 上述測定試劑盒的測定方法如下：
[0015] (1)添加15yL的校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和待測樣本到嗜鉻蛋白A抗體包被的微孔板的指 定孔中；
[0016] (2)在各孔中分別添加200yL檢測緩沖液；
[0017] (3)輕輕混勻，用封板膜密封微孔板，并用錫箱紙避光，在400rpm振動下室溫孵育 60分鐘；
[0018] (4)移開錫箱紙和封板膜，在洗板機(jī)上，用350yL洗滌液將各孔均清洗5次，然后 吸干；如有洗滌液殘存，輕輕拍干；
[0019] (5)在各孔中添加100yL嗜絡(luò)蛋白A不蹤抗體；
[0020] (6)輕輕混勻，用封板膜密封微孔板，并用錫箱紙避光，在400rpm振動下室溫孵育 60分鐘；
[0021] (7)移開錫箱紙和封板膜，在洗板機(jī)上，用350yL洗滌液將各孔均清洗5次，然后 吸干；如有洗滌液殘存，輕輕拍干；
[0022] (8)在各孔中添加100yL的ELISAHRP基質(zhì)；
[0023] (9)輕輕混勾，用錫箱紙避光，室溫靜置孵育20分鐘；
[0024] (10)移開錫箱紙，在各孔中添加100yL的ELISA終止液，輕輕混勻；
[0025] (11)讀取450nm/630nm處的兩個波長光密度值（0D值）；根據(jù)樣本的光密度值在 標(biāo)準(zhǔn)曲線上的范圍，可直接讀出樣本測定濃度。
[0026] 所述的人嗜鉻蛋白A測定試劑盒用于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，包括類癌瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、 神經(jīng)母細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)腺瘤、垂體瘤和胰島瘤，以及MEN1和MEN2綜 合征等的輔助診斷、效率評估及動態(tài)監(jiān)測。
[0027] 上述測定試劑盒采用"雙抗體夾心"技術(shù)。將校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和待測樣本加入到嗜 鉻蛋白A抗體包被的微孔板中，孵育后，清洗微孔板。加入嗜鉻蛋白A示蹤抗體，孵育后， 形成"雙抗體夾心"結(jié)構(gòu)，清洗微孔板。加入基質(zhì)溶液，孵育后，用酶標(biāo)儀測量光密度值（0D 值）。微孔板內(nèi)免疫復(fù)合體的酶活性與待測樣本中的嗜鉻蛋白A濃度成正比。根據(jù)校準(zhǔn)品 中不同的嗜鉻蛋白A濃度的光密度值，按照"點(diǎn)到點(diǎn)"或者"4-參數(shù)法"繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測 樣品中的嗜鉻蛋白A濃度可以直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取。
[0028] 本發(fā)明的有益效果是：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的人嗜鉻蛋白A的免疫測定 法及測定試劑盒具有特異性高、片段存在穩(wěn)定性好、檢測準(zhǔn)確度高等優(yōu)勢；本發(fā)明提供的嗜 鉻蛋白A免疫測定法中，通過抗體與CGA氨基酸序列中的第1~113位、第124~143位、 第322~364位及第373~439位的表位特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)樣品中CGA的定量測定；本發(fā) 明提供的測定試劑盒可達(dá)到以下幾點(diǎn)性能指標(biāo)：（1)最低檢測限：樣本為5%的牛血清白 蛋白，最低檢測限彡5ng/ml;(2)線性范圍：10~670ng/ml，r彡0.990 ;(3)精密度：批內(nèi) CV彡12% ; (4)準(zhǔn)確度：添加回收率85%~115%。
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發(fā)明中嗜鉻蛋白A的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0030] 圖2為本發(fā)明中測定試劑盒的工作原理圖（雙抗體夾心）。
[0031] 圖3為本發(fā)明中抗體與嗜鉻蛋白A氨基酸序列的結(jié)合位點(diǎn)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] -種人嗜鉻蛋白A的免疫測定法，所述的免疫測定法包括將待測定人嗜鉻蛋白A 含量的樣品與一組抗體反應(yīng)；其中至少一種抗體與人嗜鉻蛋白A氨基酸序列中的第1~ 113位氨基酸的表位特異性結(jié)合；其中至少一種抗體與人嗜鉻蛋白A氨基酸序列中的第 124~143位氨基酸的表位特異性結(jié)合；其中至少一種抗體與人嗜鉻蛋白A氨基酸序列中 的第322~364位氨基酸的表位特異性結(jié)合；其中至少一種抗體與人嗜鉻蛋白A氨基酸序 列中的第373~439位氨基酸的表位特異性結(jié)合；上述與人嗜鉻蛋白A氨基酸序列中的第 1~113位、第124~143位、第322~364位或第373~439位氨基酸的表位特異性結(jié)合 的抗體中，其中至少一種為捕捉抗體；上述與人嗜鉻蛋白A氨基酸序列中的第1~113位、 第124~143位、第322~364位或第373~439位氨基酸的表位特異性結(jié)合的抗體中，其 中至少一種抗體為示蹤抗體。
[0035] 本實(shí)施例中采用的抗體為單克隆抗體。
[0036] 本實(shí)施例中，嗜鉻蛋白A捕捉抗體固定于固定相上，該固定相為微孔板。
[0037] 本實(shí)施例中，嗜鉻蛋白A示蹤抗體采用辣根過氧化物酶標(biāo)記。
[0038] 本實(shí)施例中，采用的測定試劑盒主要包括如下組分：嗜鉻蛋白A抗體包被的微孔 板、嗜鉻蛋白A示蹤抗體、ELISA濃縮洗滌液、ELISAHRP基質(zhì)、ELISA終止液、檢測緩沖液、 嗜鉻蛋白A校準(zhǔn)品以及嗜鉻蛋白A質(zhì)控品；所述的嗜鉻蛋白A校準(zhǔn)品和嗜鉻蛋白A質(zhì)控品 均為凍干粉狀態(tài)的嗜鉻蛋白A抗原。
[0039] 其中，嗜鉻蛋白A示蹤抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的嗜鉻蛋白A抗體；ELISA濃縮 洗