一種利用分離式生物試劑點陣檢測生物分子的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測領域，更具體地說，涉及一種利用分離式生物試劑點陣檢測生物分子的方法。
【背景技術】
[0002]大量生物試劑的出現(xiàn)，例如成千上萬條DNA克隆序列，眾多抗體和重組蛋白和數(shù)百萬個通過化學合成的分子，促進了這些試劑在生物研究、臨床診斷和藥物開發(fā)等方面的應用。生物試劑點陣技術是近來發(fā)展較快的應用技術之一。在生物試劑點陣中，每個試劑被放在預先指定的位置上以便之后能通過這個位置來識別它。例如，在一個DNA點陣中(也被稱為基因芯片)，多種cDNA或寡核苷酸被固定在載體上，每一個被放在一個預先指定的位置。DNA點陣被用在雜交試驗中，來監(jiān)測大量基因的表達(Schena etal.，Science, 1995，270:467-470 ;DeRisi et al., Nature Genetics, 1996，14:457-460)。
[0003]在一個蛋白點陣(或蛋白芯片)中，多種蛋白被固定在一個支持體上，每一個被放在一個預先指定的位置上。有兩種類型的蛋白點陣最為常用:抗體點陣和重組蛋白點陣，它們分別包括大量不同的抗體和重組蛋白。因為抗體點陣能夠與細胞中表達的蛋白結合，它們在檢測蛋白的體內(nèi)活性方面極為有用?？贵w點陣已被應用在研究在體內(nèi)蛋白與蛋白相互作用、蛋白翻譯后修飾以及蛋白表達(美國專利申請?zhí)枮閁S19980126483，公開號為US 6197599B1)。另外，細胞、組織、脂類分子、多肽、藥物或其他化學物質組成的點陣能夠用在醫(yī)療診斷、藥物開發(fā)、分子生物學、免疫和毒理學等方面進行大規(guī)模的篩選檢測試驗中(Kononen, et al., Nature medicine, 1998, 4:844-847)。
[0004]蛋白質是細胞的重要組成成分，在細胞活動過程中發(fā)揮作用。細胞中的蛋白表達種類及數(shù)量決定它的形狀和功能，異常的蛋白表達會引起疾病。生物醫(yī)學研究的一個主要任務就是檢測生物樣品中蛋白的表達模式。由于翻譯后修飾，有特定氨基酸一級序列的蛋白質在細胞中可能以不同的形式出現(xiàn)，在許多情況下，只有某些特殊形式的蛋白直接參與細胞某種特定活動，所以檢測在細胞中表達的這些特殊形式的蛋白可以對了解細胞的活性和功能提供有價值的信息。蛋白有很多種不同的翻譯后修飾，如磷酸化、糖基化和泛昆化。絲氨酸、蛋氨酸或組氨酸殘基的磷酸化在信號傳導上是一個重要的機制，異常的蛋白磷酸化導致了許多人類疾病。在檢測蛋白磷酸化的方法中，經(jīng)常使用的方法是用放射性同位素代謝標記細胞和用抗體免疫檢測，抗磷酸化殘基特異抗體，例如PY20和4G10，也經(jīng)常用來檢測磷酸化蛋白。
[0005]檢測蛋白質的表達在多個領域有應用，包括生物醫(yī)學的研究、疾病診斷、尋找治療指標和藥物靶點以及在毒理和藥效反映分析方面。在基礎生物醫(yī)學研究方面，經(jīng)常希望知道哪些蛋白在特殊的細胞或特殊條件下表達，通過比較不同類型細胞的蛋白表達，就可能鑒別哪些蛋白的表達和活性決定一個特殊細胞的性質。在許多信號傳導通道中，一些蛋白被特異性地激活，檢測這些被激蛋白，例如磷酸化蛋白，會為了解信號傳導通道的原理提供關鍵的信息。許多疾病會改變蛋白的表達模式，而且在許多情況下異常的蛋白表達可以引發(fā)疾病。因此，確定蛋白的表達模式以及對比正常和異常細胞的蛋白表達模式對于了解疾病的機理是有用的。檢測某些蛋白的表達在臨床診斷上也有廣泛應用。很多臨床檢測方法都基于檢測樣品中的蛋白質標志物，如病毒的抗原和身體里產(chǎn)生的抗體。另外，檢測蛋白表達在藥物開發(fā)領域，例如藥物靶作用點的選擇，毒理學及尋找藥物反應的指標是非常有用的。
[0006]檢測蛋白質的方法很多，包括基于抗原-抗體特異性結合的免疫方法和其它非免疫方法。在眾多非免疫方法中，質譜是一個比較常用的方法。這一技術是通過將蛋白質分子轉化為氣相離子，然后利用電場、磁場將具有特定質量與電荷比值(M/Z)的蛋白質離子分離，收集，確定離子的M/Z值，來分析鑒定蛋白質。質譜技術可以用來鑒定蛋白但不適于定量檢測比較蛋白質的表達和一些其它特性，特別是不適于研究細胞內(nèi)表達高度復雜且高度動態(tài)化的蛋白。蛋白質檢測的免疫學方法也有很多，有著各自的工作原理、特點和優(yōu)缺點。研究領域常用的方法有酶聯(lián)免疫反應(ELISA)、蛋白免疫印跡技術(Western blotting)、免疫化學染色等。疾病檢測中還經(jīng)常用到穿流法(flow through)、側流免疫層析法(lateralflow immunoassay)等。
[0007]蛋白質點陣技術的出現(xiàn)為大規(guī)模檢測蛋白質提供了一個有效的方法。根據(jù)蛋白點陣的使用模式，可分為二類:捕獲式蛋白點陣和分離式蛋白點陣。簡單說，捕獲式蛋白點陣用來把生物樣品中的生物分子捕獲到點陣支持體上。而分離式蛋白點陣，一方面可維持蛋白在點陣支持體上的位置；另一方面，當與固定在另一個支持體上的生物分子結合后，蛋白可離開點陣支持體而轉移到生物分子支持體上，并且保持每一個蛋白的原有相對位置(Wang, Immunostaining with dissoiable antibody microarrays.Proteomics, 2004, 4, 20-26)。
[0008]抗體點陣是蛋白點陣技術中發(fā)展最快的方法，技術上已經(jīng)日益成熟?？贵w點陣可以用來分析樣品之間蛋白的差異、確定相應蛋白質的性質、分析細胞提取物或者血清蛋白質混合物。使用捕獲式抗體點陣的一般方法是將抗體點陣與溶液中的蛋白樣品孵育，使點陣上的抗體與樣品中的蛋白(抗原)反應、結合，從而把它們捕獲在點陣上；之后，被捕獲的蛋白進一步被檢測出來。在捕獲式蛋白點陣技術中檢測被捕獲的蛋白的方法有:標記法(tag label-based approach)和非標記法(label-free approach)。在標記法中，蛋白樣品首先用一個標記物(生物素、地高辛等)標記，然后與蛋白芯片孵育結合，結合在點陣上的蛋白通過標記來顯示。在最常用的雙色標記法中(two-color detect1n method)，兩個蛋白樣品分別用不同顏色的標記物(如Cy3和Cy5)標記，兩個樣品混合后與一個抗體點陣結合。非標記法類似于酶聯(lián)免疫法(ELISA)，在這一所謂的‘三明治’方法中(Multiplexsandwich as say)，沒有標記的蛋白樣品與蛋白點陣結合后，用含有多種抗體的混合物來檢測結合在點陣上的蛋白。
[0009]分離式抗體點陣是一種新型的、特殊的抗點陣，它一方面可維持抗體在點陣支持體上的位置；另一方面，當抗體與固定在另一個支持體上的抗原分子結合后，可離開點陣支持體而結合在抗原支持體上(Wang, Immunostaining with dissociable antibodymicroarrays.Proteomics, 2004, 4, 20-26)。分離式抗體點陣的一個重要應用是用來檢測生物樣品的蛋白。具體方法是，當固定在第一個支持體上的抗體點陣與固定在第二個支持體上的蛋白樣品接觸時，抗體將與蛋白樣品中的對應抗原相結合，第一個支持體與第二個支持體分離后，在適當條件下，與抗原結合的抗體將從第一個支持體上分離而轉移到第二個支持體上，被轉移到第二個支持體上的抗體的數(shù)量與蛋白樣品中抗原的數(shù)量是成比例的。因此可以通過檢測第二個支持體上抗體的數(shù)量而得知蛋白樣品中抗原的數(shù)量。分離式抗體點陣已用來對細胞樣品進行免疫染色，檢測多種蛋白質分子在細胞中的表達和亞細胞定位圖，分析這些蛋白質分子在不同細胞樣品中的區(qū)別，但是目前關于分離式抗體點陣與生物分子點陣或生物試劑點陣聯(lián)合使用的研究報道還沒有。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]1.要解決的問題
[0011]針對現(xiàn)有捕獲式抗體點陣存在交叉反應(cross-talk)、方法特異性低等問題，本發(fā)明提供一種利用分離式生物試劑點陣檢測生物分子的方法，同時應用捕獲式抗體點陣和分離式抗體點陣來檢測多個蛋白質，能同時檢測多種蛋白，特別是組織細胞表達的蛋白，避免了交叉反應，從而提高了檢測的特異性。
[0012]2.技術方案
[0013]為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術方案如下:
[0014]—種利用分離式生物試劑點陣檢測生物分子的方法，其步驟包括:
[0015]a.將生物分子固定在第一個支持體上兩個或兩個以上的位置，形成一個生物分子點陣；
[0016]b.將分離式生物試劑固定在第二個支持體兩個或兩個以上的位置，形成一個分離式生物試劑點陣；
[0017]c.將第一個支持體上的生物分子點陣與第二個支持體上的分離式生物試劑點陣接觸，在接觸過程中，生物試劑與生物分子結合；
[0018]d.將第二個支持體與第一個支持體分離，與生物分子結合的分離式生物試劑與第二個支持體分離，轉移到第一個支持體上；
[0019]e.通過檢測轉移到第一個支持體上的分離式生物試劑，從而檢測生物分子。
[0020]一種利用分離式生物試劑點陣檢測生物分子的方法，其步驟包括:
[0021]a.將一種或多種捕獲式生物試劑分別固定在第一個支持體上，形成一個捕獲式生物試劑點陣；
[0022]b.將一種或多種分離式生物試劑分別固定在第二個支持體上，形成一個分離式生物試劑點陣；
[0023]c.將第一個支持體上的捕獲式生物試劑點陣與生物樣品中的一種或多種生物分子結合，從而把生物分子捕獲到第一個支持體上；
[0024]d.然后將第一個支持體與第二個支持體接觸，使得固定在第二個支持體上的分離式生物試劑點陣與第一個支持體上的生物分子相接觸，分離式生物試劑與第一個支持體上的生物分子相結合；隨后將第一個支持體與第二個支持體分離，分離式生物試劑離開第二個支持體而轉移到第一個支持體上；
[0025]e.檢測第一個支持體上的分離式生物試劑，從而得到生物樣品中的生物分子的含量。
[0026]優(yōu)選地，將所述的步驟d修改為:先將被捕獲生