一種鉻-IgG螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種鉻-IgG螯合物及其制備方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] IgG主要由脾、淋巴結(jié)中的漿細(xì)胞合成和分泌，以單體形式存在。在個(gè)體發(fā)育過程 中機(jī)體合成IgG的年齡要晚于IgM，在出生后第3個(gè)月開始合成，3~5歲接近成年人水平。 IgG是血清中主要的抗體成分，約占血清總Ig的75%。IgG是唯一能通過胎盤的Ig，在自 然被動(dòng)免疫中起重要作用。此外IgG還具有調(diào)理吞噬、ADCC和結(jié)合SPA等作用。由于IgG 上述特點(diǎn)，IgG在機(jī)體免疫防護(hù)中起著主要的作用，大多數(shù)抗菌、抗病毒、抗毒素抗體都屬于 IgG類抗體。應(yīng)用對(duì)麻疹、甲型肝炎等有免疫力的產(chǎn)婦或正常人丙種或胎盤球蛋白可進(jìn)行人 工被動(dòng)免疫，能有郊地預(yù)防相應(yīng)的傳染性疾病。
[0003] 絡(luò)（chromium，Cr)是元素周期表VI族中的一種過渡金屬，其質(zhì)地堅(jiān)硬，表面具有 光澤，有較高的熔點(diǎn)，在工業(yè)生產(chǎn)中具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，一個(gè)世紀(jì)以來被廣泛應(yīng)用，每年 全球鉻生產(chǎn)量高達(dá)107噸，因而鉻是一種名副其實(shí)的重要金屬污染物。目前，鉻廣泛應(yīng)用于 電鍍、鞣革、顏料、油漆、合金、印染等各個(gè)方面，與人們的生活息息相關(guān)，但是同樣也對(duì)人 類的身體健康產(chǎn)生巨大影響。在美國(guó)，Cr與Hg、Cd、Pb被稱為四大環(huán)境污染物。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每 年有幾十個(gè)億的民眾都在飲用鉻污染的水源，而在加利福利亞有高達(dá)30%的水資源都已經(jīng) 被鉻污染，因而鉻污染嚴(yán)重影響著人們的身體健康。
[0004]自然界中鉻主要以三價(jià)和六價(jià)的形式存在，而一般認(rèn)為，三價(jià)鉻是人類所需的微 量元素，而六價(jià)鉻才是明顯的毒性物質(zhì)。由于六價(jià)鉻易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，而且可以通過 一系列反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性及基因毒性，因而普遍認(rèn)為六價(jià)鉻的毒性高于三價(jià)鉻，達(dá) 10 -100倍。學(xué)者認(rèn)為當(dāng)水中的六價(jià)鉻含量超過0.05mg/L即是有毒的。六價(jià)鉻可以通過皮 膚接觸、食物攝入、飲用水飲入、呼吸道吸入等途徑進(jìn)入人體，對(duì)于職業(yè)性暴露人群主要是 通過呼吸道吸入六價(jià)鉻灰塵，而對(duì)于普通人群則是通過飲入污染水源、食入被污染的食物、 吸入等方式攝入六價(jià)鉻。六價(jià)鉻進(jìn)入體內(nèi)后，可以引發(fā)氧化應(yīng)激、染色體畸變、細(xì)胞凋亡、多 種DNA損傷（包括單鏈斷裂、DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)、DNA-氨基酸交聯(lián)、Cr-DNA配合物形成等），從 而造成機(jī)體多處組織、器官、系統(tǒng)損傷。不僅如此，六價(jià)鉻還被認(rèn)為是一種強(qiáng)有力的致癌物， 早在 1990 年國(guó)際癌癥研究組織（InternationalAgencyforResearchonCancer，IARC) 就將六價(jià)鉻作為一種人類致癌物。關(guān)于六價(jià)鉻的細(xì)胞毒性、基因毒性、致癌性已成為當(dāng)前廣 泛研究的課題。
[0005] 關(guān)于鉻中毒，特別是慢性鉻中毒的評(píng)價(jià)，僅能通過檢測(cè)血鉻含量，間接反應(yīng)人體內(nèi) 的循環(huán)鉻含量，無法進(jìn)一步評(píng)估鉻對(duì)于機(jī)體功能的損傷程度，而隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展， 鉻與人體的關(guān)系也日益緊密，因而尋找一種可以從機(jī)體功能角度評(píng)價(jià)鉻中毒，特別是慢性 鉻中毒對(duì)于機(jī)體的損害程度的評(píng)價(jià)方式日益重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)鉻污染嚴(yán)重的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種鉻-IgG螯合物及其制備方 法，并建立鉻-IgG螯合物的定性、定量檢測(cè)方法，以便定量檢測(cè)鉻-IgG螯合物在評(píng)價(jià)一個(gè) 地區(qū)鉻污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測(cè)一個(gè)地區(qū)人群血清中鉻-IgG螯合物可以間接反映 這個(gè)地區(qū)人群受鉻污染的情況，從而間接反映這個(gè)地區(qū)鉻污染程度。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：提供一種鉻-IgG螯合物，鉻離子與 IgG通過巰基或/和半胱氨酸殘基螯合而成。
[0008] 本發(fā)明還提供一種上述的鉻-IgG螯合物的制備方法，包括以下步驟：
[0009] A)鉻與IgG的螯合反應(yīng)：在人源的IgG中加入鉻離子進(jìn)行螯合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶 液；
[0010] B)純化鉻-IgG螯合物的提?。翰捎妹庖哂H和層析法，去除反應(yīng)溶液中未反應(yīng)的 IgG以及多余的鉻離子，即得鉻-IgG螯合物。
[0011] 其中，體外合成法中所述步驟B)具體如下：
[0012] (1)溶解樣品：向經(jīng)過步驟A)得到的反應(yīng)溶液中加入生理鹽水，使鉻-IgG螯合物 復(fù)溶；
[0013] (2)平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與IgG特 異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0014] (3)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，IgG與 填料特異性結(jié)合；
[0015] (4)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.lmol/L的磷 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫；
[0016] (5)收集：收集經(jīng)過步驟（4)洗脫后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性；
[0017] (6)透析：將步驟（5)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用ddH20透析除鹽，換水三次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0018] (7)平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鉻特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0019] (8)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（6)中樣本，然后上柱；
[0020] (9)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磷 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫；
[0021] (10)收集：收集經(jīng)過步驟（9)洗脫后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性；
[0022] (11)透析：將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用ddH20透析除鹽，換水三 次后，4°C透析過夜，收集樣本，即得鉻-IgG螯合物。
[0023] 其中，上述鉻-IgG螯合物的制備方法，還包括步驟C):對(duì)鉻-IgG螯合物的鑒定；
[0024] 其中，步驟C)中具體如下：
[0025] (1)制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[0026] (2)加樣：取步驟B)中提取純化得到的鉻-IgG螯合物，加入稀釋緩沖液，并混勻， 然后加樣于樣品槽中；
[0027] (3)電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳；
[0028] (4)檢測(cè)：在膠床上找出含鉻的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶復(fù)溶， 然后再采用ICP-MS法、AAS法或ELISA法檢測(cè)是否含有鉻以及檢測(cè)鉻的含量。
[0029] 本發(fā)明還提供一種如上述的鉻-IgG螯合物在制備檢測(cè)人體內(nèi)鉻-IgG螯合物的試 劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的鉻-IgG螯合物作為對(duì)照品的試劑盒。
[0031] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有可捕獲IgG的蛋白或捕獲金屬 鉻的物質(zhì)。
[0032] 本發(fā)明還提供一種定量檢測(cè)鉻-IgG螯合物的方法，以已知含量的上述的鉻-IgG 螯合物作為對(duì)照品，采用以下方法之一對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)：酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收 光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純鉻-IgG螯合物與酶聯(lián)免疫結(jié) 合法、提純鉻-IgG螯合物與原子吸收光譜結(jié)合法、提純鉻-IgG螯合物與電感耦合等離子體 質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0033] 實(shí)施本發(fā)明的鉻-IgG螯合物及其制備方法和應(yīng)用，具有以下有益效果：
[0034] 1.本發(fā)明首次體外合成鉻-IgG螯合物；
[0035] 2.本發(fā)明首次提出鉻-IgG螯合物可用于制備檢測(cè)血樣中鉻-IgG螯合物的試劑或 試劑盒中的應(yīng)用。
[0036] 3.本發(fā)明建立了鉻-IgG螯合物的定性定量檢測(cè)方法，以便定量檢測(cè)鉻-IgG螯合 物在評(píng)價(jià)一個(gè)地區(qū)鉻污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測(cè)一個(gè)地區(qū)人群血清中鉻-IgG螯合物 可以間接反映這個(gè)地區(qū)人群受鉻污染的情況，從而間接反映這個(gè)地區(qū)鉻污染程度。本發(fā)明 建立的鉻-IgG螯合物定量檢測(cè)方法其準(zhǔn)確度大大提高，并且使檢測(cè)的重復(fù)性得到大大提 尚。
【附圖說明】
[0037] 圖1為本發(fā)明所述的鉻-IgG螯合物的非變性電泳條帶圖；
[0038] 圖2為本發(fā)明所述的鉻-IgG螯合物的同步輻射X線電泳條帶的熒光分析圖；
[0039] 其中，圖1中，M為Marker，5為鉻-IgG螯合物；圖2中，橫坐標(biāo)為蛋白條帶位置， 縱坐標(biāo)為該蛋白條帶中鉻金屬能量。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面，結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0041] 本發(fā)明除特別說明外，涉及的實(shí)驗(yàn)操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟，所用試劑、材 料如下述所列舉，在本發(fā)明中沒有列舉出來的均為本領(lǐng)域常用的試劑或可以通過市購(gòu)方式 獲得：
[0042] 提取試劑為PEG溶液、硼酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0043] 膠床介質(zhì)為瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種；
[0044] 本發(fā)明中的所述能與IgG特異性結(jié)合的填料，為表面附有能捕獲IgG的蛋白的硅 膠或樹脂；
[0045] 本發(fā)明中的能捕獲IgG的蛋白（抗IgG抗體），包括但不限于兔Anti-人類IgG H&L，其品牌為Abeam、型號(hào)為ab6715 ;
[0046] 本發(fā)明中的能與鉻特異性結(jié)合的填料，為表面附有能捕獲鉻的物質(zhì)的硅膠或樹 脂；
[0047] 本發(fā)明中的能捕獲鉻的物質(zhì)，包括但不限于鼠抗CrmAb，購(gòu)買自廣州然科公司、貨 號(hào)為RK10641 ;
[0048] 酶標(biāo)抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種；
[0049] 底物為甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液；
[0050] 洗滌液為含有KH2P040 . 2mg/ml、Na2HP04 ? 12H20 2. 90mg/ml、NaC18.Omg/ml、KC1 0? 2mg/ml、0. 5%Tween-20 的pH為 7. 4 的 0? 15MPBS溶液；
[0051] 封閉液為1% _5 %牛血清白蛋白或脫脂奶粉；
[0052] 稀釋緩沖液為含 1. 5mg/mLNa2C03、2. 93mg/mlNaHC03的PH為 9. 6 的 0? 05M磷酸 鹽緩沖液；
[0053] 酶標(biāo)抗體為HRP酶標(biāo)抗體；
[0054] 終止液為：將21. 7ml的2MH2S04定容至200ml的ddH20中；
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