檢測五氯酚鈉的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，具體涉及一種用于檢測五氯酚鈉的酶聯(lián)免疫試劑 盒，可定性、定量檢測蝦肉、魚肉、豬肉及水樣本中五氯酚鈉藥物的殘留量。
【背景技術(shù)】
[0002] 五氯酸鈉（Pentachlorophenol-Na，簡寫PCP-Na)是五氯酸的鈉鹽，屬有機(jī)氯農(nóng) 藥，通常為白色針狀或鱗片狀結(jié)晶，易揮發(fā)，有明顯的刺鼻氣味。易溶于水，4°C時溶解度為 20. 8%，其水溶液有強烈的酚臭味，性質(zhì)穩(wěn)定，在陽光的直接照射下不易分解。五氯酚鈉作 為一種高效、廉價的殺蟲劑、抗菌劑、防腐劑和除草劑，在世界范圍內(nèi)被廣泛使用。20世紀(jì) 50-60年代，我國曾經(jīng)大量使用五氯酚鈉鹽殺滅血吸蟲的寄主釘螺，效果明顯，但五氯酚鈉 性質(zhì)比較穩(wěn)定，對水體造成污染。同時，五氯酚鈉在動植物體內(nèi)的富集率高，可通過食物鏈 進(jìn)入人體，嚴(yán)重危害人體健康。因此，美國環(huán)境保護(hù)署（EPA)將五氯酚鈉列為可疑致癌物 質(zhì)，并限制其使用。我國農(nóng)業(yè)部于2002年也將五氯酚鈉列入《食品動物禁用的獸藥及其化 合物清單》，禁止在水生動物養(yǎng)殖中使用。
[0003] GB29708-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)動物性食品中五氯酚鈉殘留量的測定》使用氣 相色譜-質(zhì)譜法測定動物性食品中的五氯酚鈉殘留量，儀器方法具有靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確 等優(yōu)點，但是資金和人員等投入成本較高。本發(fā)明應(yīng)用酶聯(lián)免疫法，測定蝦肉、魚肉、豬肉及 水樣本中五氯酚鈉藥物的殘留量，具有檢測限低、特異性強、操作簡便、檢測速度快、檢測成 本低，非常容易推廣等優(yōu)點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種能夠檢測蝦肉、魚肉、豬肉及水樣本中五氯酚鈉藥物 殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒，并提供一種高效、準(zhǔn)確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量 檢測方法。
[0005] 本發(fā)明試劑盒，它包括：包被有包被原的酶標(biāo)板、五氯酚鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)二抗、 五氯酚鈉特異性抗體、底物顯色液、終止液、洗滌液、復(fù)溶液，所述包被原為五氯酚鈉偶聯(lián)抗 原，所述酶標(biāo)二抗為酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體。
[0006] 所述五氯酚鈉偶聯(lián)抗原是由五氯酚鈉半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述五氯酚鈉 半抗原是由五氯酚鈉和4-溴丁酸乙酯反應(yīng)得到，所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋 白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白或纖維蛋白原。
[0007] 所述五氯酚鈉特異性抗體是以五氯酚鈉偶聯(lián)抗原作為免疫原制備獲得，所述五氯 酚鈉特異性抗體可為五氯酚鈉單克隆抗體或五氯酚鈉多克隆抗體，其中優(yōu)選五氯酚鈉單克 隆抗體。
[0008] 所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選辣 根過氧化物酶；酶標(biāo)二抗是采用改良后的過碘酸鈉法進(jìn)行偶聯(lián)得到的。
[0009] 為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括五氯酚鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液、 底物顯色液、終止液、洗滌液、復(fù)溶液。
[0010] 所述五氯酚鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0i!g/L、0. 05i!g/L、0. 15i!g/L、 0.45ug/L>1. 35ug/L>4. 05ug/L〇
[0011] 當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時，所述底物顯色液由底物液A液和底物液B液組成， A液為過氧化氫或過氧化脲，B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，所述終止液為1~2mol/L的 硫酸或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶時，所述底物顯色液為對硝基磷酸 鹽緩沖液，所述終止液為1~2mol/L氫氧化鈉溶液。
[0012] 所述洗滌液優(yōu)選為口11值為7.4，含有0.5%~1.0%吐溫-20、0.01%。~0.03% 〇疊 氮化鈉防腐劑、〇. 1~〇. 3mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。
[0013] 所述復(fù)溶液優(yōu)選為pH值為7. 0、0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體 積百分比。
[0014] 其中在酶標(biāo)板制備過程中所用到的包被緩沖液為pH值為9. 6,0. 05mol/L的碳酸 鹽緩沖液，封閉液為pH值為7. 1~7. 5,含有1 %~3%酪蛋白、0. 1~0. 3mol/L的磷酸鹽 緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。
[0015] 本發(fā)明中酶標(biāo)板的制備過程為：用包被緩沖液將包被原稀釋成20iig/ml，每孔加 入100iil，25°C避光孵育2h或4°C過夜，傾去孔中液體，用洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干， 然后在每孔中加入150~200yl封閉液，25°C避光孵育1~2h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后 用鋁膜真空密封保存。
[0016] 本發(fā)明的檢測原理為：
[0017] 本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中 殘留的五氯酚鈉與微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗五氯酚鈉的抗體，加入酶標(biāo)二抗后， 用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含五氯酚鈉的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以 其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中五氯酚鈉的殘留量。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測五氯酚鈉的方法，它包括步 驟：
[0019] ⑴樣品前處理；
[0020] (2)用試劑盒進(jìn)行檢測；
[0021] (3)分析檢測結(jié)果。
[0022] 本發(fā)明檢測五氯酚鈉的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用ELISA方法定性或定量檢測樣 品中五氯酚鈉的含量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批 量樣品；主要試劑以工作液的形式提供，檢驗方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確 度高、準(zhǔn)確度高等特點。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價格便宜、攜帶便 利、檢測方法高效、準(zhǔn)確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量。
【附圖說明】
[0023] 圖1 :五氯酚鈉半抗原合成路線圖
[0024] 圖2 :五氯酚鈉半抗原核磁共振氫譜圖
[0025] 圖3:試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
【具體實施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體的實施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本 發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0027] 實施例1試劑盒組分的制備
[0028] 1、五氯酚鈉半抗原的制備
[0029] 1. 0g五氯酚鈉與4溴丁酸乙酯在DMF中，在無水碳酸鉀與碘化鈉的催化下，反應(yīng)生 成五氯酚-4溴-丁酸乙酯產(chǎn)物，經(jīng)乙酸乙酯萃取，水洗，柱層析純化分離，得到中間產(chǎn)物，中 間產(chǎn)物在氫氧化鉀的水溶液中加熱反應(yīng)，水解生成半抗原，經(jīng)乙酸乙酯提取，二氯甲烷重結(jié) 晶，得到半抗原產(chǎn)物。
[0030] 取上述產(chǎn)物經(jīng)核磁共振氫譜測定，如圖2所示，化學(xué)位移在4.Oppm處的為鄰近酚 氧的亞甲基信號峰，2.Oppm處兩組為亞甲基信號峰，llppm處為羧基氫信號峰，說明半抗原 合成成功。
[0031] 2、抗原的制備
[0032] 免疫原制備--五氯酚鈉半抗原與牛血清白蛋白（BSA)偶聯(lián)得到免疫原。
[0033]取18mg半抗原，溶解于lmLDMF中，得到溶液（1)，取氯甲酸異丁酯50ul加入（1) 中，4°C下攪拌30min，得到反應(yīng)液A。稱取BSA50mg，使之充分溶解在4.OmLPBS(PH7. 2) 中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h，用0.Olmol/LPBS4°C透 析3d每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。分裝，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0034] 包被原制備--五氯酚鈉半抗原與卵清蛋白（0VA)偶聯(lián)得到免疫原。
[0035] 取18mg半抗原，溶解于lmLDMF中，得到溶液（1)，取氯甲酸異丁酯50ul加入（1) 中，4°C下攪拌30min，得到反應(yīng)液A。稱取OVA50mg，使之充分溶解在4.OmLPBS(PH7. 2) 中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h，用0. 01mol/LPBS4°C透 析3d每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。分裝，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0036] 3、五氯酚鈉單克隆抗體的制備
[0037] 動物免疫：將上述步驟得到的免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為 150iig/只，使其產(chǎn)生抗血清。
[0038] 細(xì)胞融合和克隆化：小鼠血清測定結(jié)果較高后，取其脾細(xì)胞，按8:1(數(shù)量配比）比 例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限 稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到分泌五氯酚鈉單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0039] 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇：將單克隆雜交瘤細(xì)胞株用凍存液制成IX106個/ml的細(xì)胞懸 液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37 °C水浴中速融，離心去除凍存液后， 移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
[0040] 單克隆抗體的生產(chǎn)與純化：將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0. 5ml/只，7天后 腹腔注射穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株5X105個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸 銨法進(jìn)行腹水純化，-20°C保存。
[0041] 4、酶標(biāo)二體的制備
[0042] 將羊抗鼠抗抗體與辣根