一種人體液的顯色法真菌1,3-β-D-葡聚糖檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種人體液的顯色法真菌1，3_0 -D-葡聚糖檢測試劑盒。 技術(shù)背景
[0002] 近年來，原發(fā)性和繼發(fā)性侵襲性真菌感染（invasivefungalinfections,IFI)的 患病率持續(xù)上升。IFI作為院內(nèi)感染在惡性腫瘤患者、接受化療的血液病患者、AIDS患者、 器官移植患者和接受抑制免疫力治療的患者中十分常見，致使越來越多的患者產(chǎn)生嚴(yán)重的 并發(fā)癥甚至死亡。許多真菌疾病是由于吸入污染物、植物碎屑、空氣中或暴露表面的真菌孢 子引起，另有一些常見真菌存在于人類皮膚、腸道和粘膜中也可作為致病菌造成感染。目前 侵襲性真菌感染和真菌血癥的診斷通常采用非特異性診斷或者放射學(xué)技術(shù)，陽性率低，檢 測周期長，不能及時(shí)的為臨床提供診斷依據(jù)。
[0003] 1，3- 3-D葡聚糖是酵母和絲狀真菌細(xì)胞壁的多聚糖成分，而原核生物、病毒和人 體細(xì)胞都不存在這種多聚糖，當(dāng)真菌進(jìn)入人體血液或深部組織后，經(jīng)中性粒細(xì)胞及吞噬細(xì) 胞的處理，1，3-3 -D-葡聚糖可從真菌細(xì)胞壁釋放出來進(jìn)入血液及其他體液中，在淺部真菌 感染中，1，3-P-D-葡聚糖未被釋放出來，故在體液中的量不增高。因此，1，3-P-D-葡聚糖 在血液及無菌體液中的含量成為侵襲性真菌感染診斷標(biāo)準(zhǔn)。
[0004] 通常人原發(fā)性真菌病原體有念珠菌屬和曲霉菌屬，繼發(fā)性真菌病原體包括梭霉 菌屬、梭霉菌屬、釀酒酵母、支頂孢屬、粗球孢子菌、夾膜組織胞漿菌、卡氏肺孢子菌等。1， 3- 3 -D-葡聚糖都存在于這些真菌的細(xì)胞壁中，因此，通過檢測人體液中1，3- 3 -D-葡聚糖 含量即可有效的篩查侵襲性真菌感染。目前中、美、日三國基于鱟的血凝集反應(yīng)原理，利用 鱟的血細(xì)胞裂解物，通過一系列酶反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)1，3-0 -D-葡聚糖檢測。
[0005] 當(dāng)血液包含兩類細(xì)胞，其中一類為顆粒細(xì)胞（graniiLarhemocyte或 graniiLocyte)或稱之為變形細(xì)胞（amebactye),成年當(dāng)只含有這類細(xì)胞。當(dāng)血液凝集與哺 乳動(dòng)物的血液凝集相似，是一系列級聯(lián)酶反應(yīng)。1981年，Morta從鱟血變形細(xì)胞中分離出一 種酶，成為G因子，同年日本學(xué)者kakinuma等證明霉菌細(xì)胞壁中普遍存在CMPS，它可活化G 因子，活化G因子又可使凝固酶產(chǎn)生凝集反應(yīng)，從而證明了鱟試劑凝集反應(yīng)的一條途徑，即 在G因子和凝固酶原的存在下，可與CMPS類物質(zhì)產(chǎn)生凝集作用，可用于臨床1，3-0 -D-葡 聚糖檢測。
[0006] 公布日為2012年1月4日，公布號為102305787的中國發(fā)明專利申請《真菌 (1-3) -P-D葡聚糖比色檢測試劑盒的制備及其使用方法》公開了一種通過利用（1-3) - 3-D 葡聚糖來激活鱟血G因子，進(jìn)一步水解顯色基質(zhì)后，通過分光光度計(jì)進(jìn)行吸光度檢測來達(dá) 到檢測（l-3)-P-D葡聚糖的目的。該方法的問題在于所需配置顯色試劑較多，操作繁瑣， 且中間過程中容易有外界細(xì)菌污染介入，影響檢測結(jié)果。
[0007] 公告日為2013年1月9日，公布號為102866255的中國發(fā)明專利申請《一種人體 液真菌（1，3)-0 -D葡聚糖檢測試劑盒及其應(yīng)用方法》公開了一種通過利用傳統(tǒng)的鱟試劑制 備方法制備，濁度法檢測真菌（1，3)-P-D葡聚糖的試劑盒。此真菌（1，3)-P-D葡聚糖檢 測試劑盒所依據(jù)的濁度法檢測靈敏度較低，另外反應(yīng)主劑易受到體液標(biāo)本中蛋白及藥物的 干擾產(chǎn)生非特異性濁度，從而使檢測結(jié)果假陽性升高，檢測準(zhǔn)確度較低。
[0008] 專利201010221407. 9提供了一種直接真菌檢測鱟試劑盒及方法，所述試劑盒 組成包括：（1)G試劑：為鱟血球細(xì)胞溶解物與發(fā)色物質(zhì)的混合物；（2)緩沖液：0. 02~ 0.lmol/LTris-HCl; (3)標(biāo)準(zhǔn)品：（1-3) - 0 -D-葡聚糖；(4)重氮化試劑；（5)血液處理液。 通過對樣品、標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行處理，配制G試劑溶液，分裝、加溫、終止，然后測定吸光值，作出標(biāo) 準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的（l-3)-P-D-葡聚糖含量。該試劑盒能快速、準(zhǔn)確地定量人體血液及 體液標(biāo)本中的微量（1-3) _P-D-葡聚糖，此專利中發(fā)色物質(zhì)為Boc-LGR-pNA，使用重氮化試 劑將反應(yīng)終止后，終點(diǎn)法檢測吸光度，此設(shè)計(jì)檢測步驟線路長，引入干擾物的幾率大，使得 檢測時(shí)間延長，靈敏度較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明為解決公知技術(shù)中存在的技術(shù)問題而提供一種操作簡單、設(shè)計(jì)合理、檢測 快速、準(zhǔn)確度高的一種人體液的顯色法真菌L3-3-D-葡聚糖檢測試劑盒及其應(yīng)用方法。
[0010] 本發(fā)明為解決公知技術(shù)中存在的技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是：
[0011] -種人體液的顯色法真菌1，3-3 -D-葡聚糖檢測試劑盒，其特征在于包括：
[0012] 反應(yīng)主劑；
[0013] 主劑復(fù)溶液：0? 01-lmol/mLTris-HCl緩沖液和 0? 01-0. 3mol/mLMg2+ ；
[0014] 樣本處理液：〇? 5M-2mol/mLKC1 和 0? 05M-0. 5mol/mLK0H;
[0015] 無熱源水；
[0016] 標(biāo)準(zhǔn)品；
[0017] 質(zhì)控品；
[0018] 所述反應(yīng)主劑以鱟血細(xì)胞為主要原料，含有G因子、凝固酶、凝固酶原及多肽顯色 基質(zhì)。
[0019] 所述反應(yīng)主劑的制備方法包括以下步驟：
[0020] 1)采血與分離細(xì)胞：將活體鱟清洗，使用酒精或碘酒將心門消毒，使用無熱原不 銹鋼針采血，600-1500rpm離心，去除上清液，收集鱟血細(xì)胞；
[0021] 2)裂解：向步驟1)收集的鱟血細(xì)胞中加入加入裂解液重懸細(xì)胞，加入裂解液和鱟 血細(xì)胞的體積比1 : 2-9 : 10，-20°C冷凍12小時(shí)以上，然后解凍，解凍后即得鱟血細(xì)胞溶 解物；
[0022] 3)提取分離：向步驟2)制得的鱟血細(xì)胞溶解物中加入氯仿，加入氯仿與鱟血細(xì)胞 溶解物的體積比1 : 〇. 5-1 : 1，攪拌混合5-20分鐘，4°C，6000-8000rpm下離心20-30分 鐘，取上清液；
[0023] 4)制劑：向步驟3)制得的上清液中加入B、C因子抑制劑和多肽顯色基質(zhì)，使每毫 升上清液中B、C因子抑制劑含量為0. 5-3mg，多肽顯色基質(zhì)0. 5-2mg，冰浴攪拌3-5min;所 述B、C因子抑制劑為對B、C因子特異性相對較高的絲氨酸蛋白抑制劑，所述多肽顯色基質(zhì) 為Gly-Arg末端連接PNA的合成三肽或四肽；
[0024] 5)真空冷凍干燥：將步驟4)得到的液體分裝至西林瓶或安瓿瓶中，真空冷凍干 燥，得到反應(yīng)主劑。
[0025] 所述多膚顯色基質(zhì)為Boc-Leu-Gly-Arg-PNA或Boc-Ile-Gly-Arg-PNA。
[0026] 所述樣本處理液的制備方法，采用無熱源水配制0? 05mol_0. 5mol/mLK0H和 0? 5mol-2mol/mLKC1，使用時(shí)將已配制的兩種溶液等體積混合即為樣本處理液。
[0027] 所述主劑復(fù)溶液的制備方法，按處方用顯分別稱取Tris-HCl和MgCl2，置投料容器 內(nèi)，添加無熱源水至配制量，使得每毫升溶液含Tris-HClO. 01-lmol和MgCl20. 01-0. 3mol， 混合均勻后，用稀鹽酸調(diào)pH，過濾分裝。
[0028] 所述主劑復(fù)溶液的pH值在6. 0-8. 0之間。
[0029] 所述無熱源水為無菌無熱原水。
[0030] 所述標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法為1，3-0-D-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品與1-8% (重量比）的賦形劑 混合，40°C~55°C冷凍5h，真空凍干，制得。
[0031] 所述質(zhì)控品的制備方法，1，3-3 -D-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品與為10% (重量比）的小牛血 清及1-8% (重量比）的賦形劑混合，零下40°C~55°C凍干，封口即得成品。
[0032] -種人體液的顯色法真菌1，3-0-D-葡聚糖檢測試劑盒的檢測方法，鱟血細(xì)胞中 G因子被待檢測樣本中1，3- 0 -D-葡聚糖激活，形成活化G因子，活化G因子使凝固酶原轉(zhuǎn) 化為凝固酶，凝固酶酶切多肽顯色基質(zhì)產(chǎn)生游離的對硝基苯胺（PNA)，PNA在405nm波長具 有明顯吸收峰并且在一定時(shí)間內(nèi)其生成速率及含量與1，3-0-D-葡聚糖含量線性相關(guān)，所 以通過檢測一定時(shí)間內(nèi)405nm吸光度的變化率對樣本中1，3-0-D-葡聚糖進(jìn)行定量檢測 (速率法），具體實(shí)施步驟包括：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作、樣本處理、檢測。
[0033] 本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為：由于鱟血細(xì)胞中G因子能夠被1，3-0 -D-葡聚 糖激活，形成活化G因子，活化G因子使凝固酶原轉(zhuǎn)化為凝固酶，凝固酶能夠特異性的酶切 多肽顯色基質(zhì)產(chǎn)生游離的對硝基苯胺（PNA)，PNA在405nm波長具有明顯吸收峰，并且在一 定時(shí)間內(nèi)其生成速率及含量與1，3-3-D-葡聚糖含量線性相關(guān)，所以能夠通過檢測一定時(shí) 間內(nèi)405nm吸光度的變化率對樣本中1，3- 0 -D-葡聚糖進(jìn)行定量檢測（速率法），這種通 過采用凝固酶酶切多肽顯色基質(zhì)（Gly-Arg末端連接PNA的合成三肽或四肽），產(chǎn)生游離 的對硝基苯胺（PNA)后，再用酶標(biāo)儀直接進(jìn)行檢測，縮短了檢測路線，降低了成本，減低了 多步反應(yīng)容易引入干擾物的可能性；而且由于酶標(biāo)儀進(jìn)行速率法酶動(dòng)力學(xué)檢測，相對濁度 法檢測，靈敏度更高，使反應(yīng)主劑不易受到體液標(biāo)本中蛋白及藥物的干擾，產(chǎn)生非特異性濁 度，從而使檢測結(jié)果假陽性的概率降低，檢測準(zhǔn)確度更高；再有整個(gè)過程中使用的顯色試劑 用量少，節(jié)約成本，更具市場競爭力。
【附圖說明】
[0034] 圖1為試劑盒1，3_P-D-匍聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0035] 圖2為標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)0D405nm變化曲線圖。
[0036] 其中曲線A為濃度為500pg/mL葡聚糖0D405nm變化曲線；曲線B為濃度為250pg/ mL葡聚糖0D405nm變化曲線；曲線。C為濃度為125pg/mL葡聚糖0D405nm變化曲線；曲 線D為濃度為62. 5pg/mL葡聚糖0D405nm變化曲線；曲線E為濃度為31. 25pg/mL葡聚糖 0D405nm變化曲線；曲線F為陰性對照0D405nm變化曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 為能進(jìn)一步了解本發(fā)明的
【發(fā)明內(nèi)容】
、特點(diǎn)及功效，例舉以下實(shí)施例，并配合附圖詳 細(xì)說明如下：
[0038] 以下結(jié)合附圖以檢測血液1，3-0-D-葡聚糖檢測應(yīng)用為例對本發(fā)明做進(jìn)一步說 明。
[0039] 1、顯色法真菌1，3-0 -D-葡聚糖檢測試劑盒的構(gòu)成包括：反應(yīng)主劑、主劑復(fù)溶液、 樣本處理液、無熱源水、標(biāo)準(zhǔn)品及質(zhì)控品。
[0040] 顯色法真菌1，3_ 0 -D-匍聚糖檢測試劑盒的生廣制造：
[0041] 1. 2、顯色法真菌1，3_ 0-D-匍聚糖檢測試劑盒的反應(yīng)主劑的制備工藝，主要是通 過對鱟血細(xì)胞溶解物的提取制備，具體包括以下步驟：
[0042] 1)采血與分離細(xì)胞：將活體鱟清洗，使用酒精或碘酒將心門消毒，使用無熱原不 銹鋼針采血，600-1500rpm離心，去除上清液，收集鱟血細(xì)胞。
[0043] 2)裂解細(xì)胞：向步驟去1)收集的鱟血細(xì)胞中加入裂解液重懸細(xì)胞，加入裂解液和 鱟血細(xì)胞的體積比1 : 2-9 : 10, -20°C冷凍12-18小時(shí)，解凍，解凍后即得鱟血細(xì)胞溶解 物；
[0044] 3)提取分離：向步驟2)制