一種人乳鐵蛋白雙抗夾心膠體金檢測試紙條的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地，涉及一種人乳鐵蛋白雙抗夾心膠體金檢測試 紙條。
【背景技術】
[0002] "碩鼠"的問世（Palmiteretal.，1982)，加速了轉基因生物的研究?？寺【d羊"多 莉"的誕生（Wilmutetal.，1997)，促進了轉基因技術在哺乳動物方面的廣泛應用。目前研 制成功多種用于生產藥用或食用蛋白、提高瘦肉率、改善營養(yǎng)、增強抗病力的轉基因豬、牛、 羊（Schniekeetal.，1997;Toledoetal.，2006)，其潛在的經濟效益和社會效益巨大，具 有良好的商品化前景。但是由于轉基因生物及其產品存在風險，轉基因生物及產品的管理 一直受到各國政府的高度重視。
[0003] 為了保護人類自身的健康和生存環(huán)境，包括我國在內的許多國家相繼制定了轉基 因生物安全法規(guī)，對轉基因生物及產品采用標識制度，對轉基因食品進出境進行嚴格管理。 要使這些法規(guī)、制度得以順利實施，需要有效的檢測技術做支撐。目前轉基因生物及其加工 食品的檢測方法主要包括基因水平的檢測和蛋白水平的檢測，在蛋白檢測方面，目前人乳 鐵蛋白的檢測方法以ELISA檢測法為主，但ELISA方法操作時間較長，而且需要酶標儀等專 業(yè)設備，不適用于現場快速檢測。因此建立一種快速、簡便的檢測方法很有必要。
[0004] 目前最適用于現場檢測的方法主要是免疫膠體金技術，免疫膠體金技術是以膠 體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。膠體金是由氯金酸 (HAuC14)在還原劑如抗壞血酸、檸檬酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并 由于靜電作用形成一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與 蛋白質分子的正電荷基團牢固結合，由于這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物 特性。根據膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合 物的免疫和生物學特性，使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領 域。
[0005] 將雙抗夾心試紙用于人乳鐵蛋白的檢測，能夠實現人乳鐵蛋白的快速簡便地檢 測；但是，現有的抗人乳鐵蛋白的抗體因敏感性和特異性較低且配對性較差，無法滿足雙抗 夾心免疫試紙檢測人乳鐵蛋白的要求。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種敏感性和特異性較高人乳鐵蛋白雙抗夾心膠體金檢測 試紙條，該試紙條能夠滿足雙抗夾心免疫試紙檢測人乳鐵蛋白的要求，實現對人乳鐵蛋白 的快速簡便地檢測。
[0007] 為了實現上述目的，本發(fā)明提供了一種人乳鐵蛋白雙抗夾心膠體金檢測試紙條， 該免疫膠體金試紙包括依次相連接的吸水墊、基膜、金標墊和樣品墊；所述基膜上設置有C 線和T線，所述C線上包被有羊抗鼠IgG的抗體，所述金標墊中含有膠體金標記的第一單 克隆抗體；所述T線上包被有第二單克隆抗體；所述第一單克隆抗體由保藏編號為CGMCC NO. 10595的雜交瘤細胞株分泌得到，所述第二單克隆抗體由保藏編號為CGMCC NO. 10594 的雜交瘤細胞株分泌得到。
[0008] 通過上述技術方案，本發(fā)明能夠通過雙抗夾心免疫試紙檢測方法，對人乳鐵蛋白 的檢測取得lOng/mL的靈敏度，對牛乳鐵蛋白和羊乳鐵蛋白不呈現交叉反應，并且對人溶 菌酶轉基因牛、人a-乳清白蛋白轉基因牛不呈現交叉反應，具有較高的敏感度和特異性。
[0009] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
[0010] 生物材料保藏
[0011] 本發(fā)明的一株雜交瘤細胞株是本發(fā)明的發(fā)明人自行融合篩選得到的，其保藏編號 為CGMCC N0. 10595,保藏日期為2015年5月8日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心，地址位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究 所，分類命名為雜交瘤細胞株。
[0012] 本發(fā)明的另一株雜交瘤細胞株是本發(fā)明的發(fā)明人自行融合篩選得到的，其保藏編 號為CGMCC N0. 10594,保藏日期為2015年5月8日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心，地址位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研 究所，分類命名為雜交瘤細胞株。
【附圖說明】
[0013] 附圖是用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具 體實施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0014] 圖1是免疫膠體金試紙的結構示意圖。
[0015] 圖2是試紙理論檢測結果示意圖。
[0016] 圖3為試紙條特異性試驗檢測圖。
[0017] 圖4為部分陽性樣品檢測圖。
[0018] 圖5為部分陰性樣品檢測圖。
[0019] 附圖標記說明
[0020]1樣品墊2膠體金墊3基膜
[0021] 4吸收墊5 T線6 C線
【具體實施方式】
[0022] 以下結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描 述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0023] 本發(fā)明提供了一種人乳鐵蛋白雙抗夾心膠體金檢測試紙條，該免疫膠體金試紙包 括依次相連接的吸水墊、基膜、金標墊和樣品墊；所述基膜上設置有C線和T線，所述C線上 包被有羊抗鼠IgG的抗體，所述金標墊中含有膠體金標記的第一單克隆抗體；所述T線上 包被有第二單克隆抗體；所述第一單克隆抗體由保藏編號為CGMCC N0. 10595的雜交瘤細 胞株分泌得到，所述第二單克隆抗體由保藏編號為CGMCC N0. 10594的雜交瘤細胞株分泌得 到。
[0024] 其中，免疫膠體金試紙的檢測原理可能包括：將待檢樣品滴入樣品墊中，若樣品 中有人乳鐵蛋白，待檢樣品中人乳鐵蛋白先和膠體金標記的第一單克隆抗體（3B4)結合， 由于毛細管作用，人乳鐵蛋白和膠體金標記的第一單克隆抗體形成的復合體沿基膜向前泳 動，到達檢測線時遇到包被在硝酸纖維素基膜上的第二單克隆抗體（5C5)，由于第一單克隆 抗體和第二單克隆抗體分別能結合人乳鐵蛋白的不同抗原表位結合，從而形成"膠體金標 記的第一單克隆抗體（3B4)-人乳鐵蛋白-第二單克隆抗體（5C5)"復合體，從而使得膠體 金富集在檢測線上，形成特異性的紅色層析線；沒有和人乳鐵蛋白結合的膠體金標記的第 一單克隆抗體則會直接通過檢測線，達到質控線后被質控線上的羊抗鼠IgG捕獲，從而使 得膠體金富集在質控線上形成紅色層析線，即判為陽性結果；若樣品中無人乳鐵蛋白，由于 無法在檢測線上形成"膠體金標記的第一單克隆抗體（3B4)-人乳鐵蛋白-第二單克隆抗 體（5C5) "復合體，從而使得檢測線上不會產生肉眼可見的顏色反應，沒有和人乳鐵蛋白結 合的膠體金標記的第一單克隆抗體則會直接通過檢測線，達到質控線后被質控線上的羊抗 鼠IgG捕獲，從而使得膠體金富集在質控線上形成紅色層析線，即判為陰性結果。
[0025] 本發(fā)明中，使用保藏編號為CGMCC N0. 10595的雜交瘤細胞株和保藏編號為CGMCC N0. 10594的雜交瘤細胞株分別制備和純化第一單克隆抗體和第二單克隆抗體的方法可以 為本領域常規(guī)的方法，例如小鼠腹水法和親和層析法。
[0026] 本發(fā)明中，將單克隆抗體進行膠體金標記的方法可以為本領域常規(guī)的方法，例如 可以包括：將0. 01重量％的HAuC14溶液加熱煮沸后加入1重量％的檸檬酸三鈉溶液直至 溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯募t色時，繼續(xù)回流l〇min后停止加熱，冷卻至室溫，即得到膠體 金；取lml制取好的膠體金，用1重量％的1(20)3調節(jié)pH值到8.0,加入8yg單克隆抗體， 混合均勻，室溫反應40min;加入5重量％的BSA至終濃度為0. 1重量％，靜置30min;先用 低速（1500r/min)離心15分鐘，棄去由凝聚的金膠粒形成的沉淀；然后用10000r/min離心 30分鐘；仔細吸出上清，沉淀物用0.lml含1%BSA的0. 1MPBS(PH7. 4)復溶，加入5%疊 氮鈉至終濃度為0. 05%，4°C保存。
[0027] 本發(fā)明中，制備免疫膠體金試紙的方法可以為本領域常規(guī)的方法，例如可以包括： 用噴金點膜機將第二單克隆抗體和羊抗鼠IgG噴于硝酸纖維素膜上，形成相互平行的檢測 T線和質控C線，然后烘干；將膠體金標記的第一單克隆抗體用噴金點膜機均勻的噴在金標 墊上；然后將樣品墊、金標墊、噴有T線和C線的基膜（硝酸纖維素膜）和吸水紙依次連接 組裝，而后裁切包裝備用。
[0028] 其中，所述金標墊中所含有膠體金標記的第一單克隆抗體可以是由5-100 y g/mL 膠體金標記的第一單克隆抗體溶液以〇.5-5 y L/cm的噴涂速度通過噴金點膜機噴涂在金 標墊上干燥后得到的。
[0029] 其中，所述T線上包被的第二單克隆抗體可以是由0. 2-5mg/mL的第二單克隆抗體 溶液以0. 2-4 y L/cm的噴涂速度噴涂在T線上干燥后得到的。
[0030] 其中，所述C線上包被的羊抗鼠IgG的抗體可以是由0. 2-5mg/mL的羊抗鼠IgG的 抗體溶液以〇.2-4 y L/cm的噴涂速度通過噴金點膜機噴涂在C線上干燥后得到的。
[0031] 以下通過實施例進一步詳細說明本發(fā)明：
[0032] 實施例1
[0033] 本實施例用于說明人乳鐵蛋白雙抗夾心膠體金檢測試紙條所用的抗體對的篩選。
[0034] 人乳鐵蛋白（hLF)的蛋白序列如NCBIGenbank序列號：U95626所示。按照 文獻(Penghua Yang, et al. , Cattle Mammary Bioreactor Generated by a Novel Procedure of Transgenic Cloning for Large-Scale Production of Functional Human Lactoferrin. ,PLoS 0NE,2008,3(10)，e3453)中的方法獲得人乳鐵蛋白（hLF)的轉基因乳 牛。
[0035] 向轉基因乳牛肌肉注射催乳針（購自西安草灘制藥廠生產的不孕牛催乳針，該產 品為盒裝，I號針10支，II號針3支）進行催乳，其中I號針連續(xù)肌肉注射10天，每日一 次。II號針在第13、15、17天各注射一支。從注射7天開始每天溫水按摩轉基因乳牛乳房， II號針注射完畢后開始人工擠乳兩周，每天兩次，得到奶樣。
[0036] 將奶樣于4°C、4500rpm離心15min后取出，可見上層為凝固的乳脂，將下層液體吸 出并轉移到另一個離心管。將脫脂乳用1M鹽酸調節(jié)pH值至3. 8-4. 6,使得酪蛋白沉淀出 來，其中脫脂乳與1M的HC1的體