Dickkopf-1與細(xì)胞凋亡在激素性股骨頭缺血性壞死中作用的研究方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，尤其涉及一種Dickkopf-I與細(xì)胞凋亡在激素性股骨 頭缺血性壞死中作用的研究方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 激素性股骨頭缺血壞死（Steroid-induced Avascular Necrosis of Femoral Head，SANFH)是指因長(zhǎng)期使用或短期大量使用腎上腺皮質(zhì)激素（以下簡(jiǎn)稱激素）后造成股 骨頭活性成分的死亡所引起的病理過程。早在20世紀(jì)50年代就已發(fā)現(xiàn)，大量使用激素可 以導(dǎo)致股骨頭壞死。目前由于臨床上對(duì)糖皮質(zhì)激素的廣泛應(yīng)用，致使SANHl的臨床病例數(shù) 大幅度增加。SANHlS非創(chuàng)傷性股骨頭壞死中發(fā)病率最高的一種類型。SANHl主要累及中青 年人群，多為雙側(cè)性，其壞死率和致殘率遠(yuǎn)高于一般的特發(fā)性股骨頭缺血壞死。2003年"非 典"以后，又涌現(xiàn)出大量SANFH病例。激素引起的SANFH是一個(gè)非常復(fù)雜的生物學(xué)過程，具 體的發(fā)病機(jī)制仍然不是很清楚，因此，探明SANHl的發(fā)病機(jī)制，仍然是該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。
[0003] 雖然自上個(gè)世紀(jì)60年代開始，許多學(xué)者就開始致力于對(duì)SANHl發(fā)病機(jī)制的研究， 但到目前為止仍未得到確切結(jié)論，現(xiàn)存在諸多比較分散的學(xué)說(shuō)，比較具有代表性的有脂肪 代謝紊亂、血管內(nèi)凝血、激素的細(xì)胞毒作用、骨內(nèi)壓增高等。但是，其確切病理生理學(xué)機(jī)制并 未明確。近年，相關(guān)基因?qū)W研究表明，SANFH與細(xì)胞凋亡、血液系統(tǒng)相關(guān)基因以及遺傳易感 性等因素有關(guān)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞凋亡理論已成為研究器官組織損傷和衰老發(fā) 生機(jī)制的重要研究方向，受到眾多國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞主動(dòng) 死亡，是多種細(xì)胞有機(jī)體為維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、調(diào)控機(jī)體發(fā)育進(jìn)行的程序化細(xì)胞死亡，為細(xì)胞 衰老自然死亡的主要方式之一。雖然細(xì)胞凋亡是一種生理過程，但或多或少都會(huì)引起疾病 發(fā)生。細(xì)胞凋亡的發(fā)生主要與氧化應(yīng)激、線粒體損傷及鈣穩(wěn)態(tài)失衡等有關(guān)；凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 通路受基因調(diào)控及許多誘導(dǎo)因素（如激素和生長(zhǎng)因子的失衡等）的影響。近年來(lái)已有許多 學(xué)者開始初步探討骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的凋亡在SANHl中的作用，對(duì)其發(fā)病機(jī)制有了新的認(rèn) 識(shí)。但遺憾的是，這些研究還尚未深入到對(duì)骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究中。而亦有研 究表明在其他疾病里如肝癌、胃癌等Wnt信號(hào)途徑與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系，但在骨細(xì)胞內(nèi) 尚未研究方法，而且有大量研究表明激素雖對(duì)Wnt受體LRP表達(dá)的影響甚微，但可顯著增加 Wnt詰抗分子Dickkopf-I的表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種Dickkopf-I與細(xì)胞凋亡在激素性股骨頭缺血性壞死 中作用的研究方法，旨在探索Dickkopf-I與細(xì)胞凋亡在激素性股骨頭缺血性壞死中的作 用，為進(jìn)一步探討激素性股骨頭缺血性壞死提供新的思路。
[0005] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種Dickkopf-I與細(xì)胞凋亡在激素性股骨頭缺血性壞死 中作用的研究方法通過收集經(jīng)全髖置換術(shù)取下的SANHl的股骨頭標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，股骨頸 骨折髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后標(biāo)本作為對(duì)照組，切取股骨頭標(biāo)本經(jīng)固定、脫鈣，制作切片，電鏡觀察 骨細(xì)胞形態(tài)變化，光鏡觀察其病理變化，并用HE染色計(jì)數(shù)空缺骨陷窩，免疫組織化學(xué)染色 法檢測(cè)Dickkopf-I的表達(dá)，用TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)骨細(xì)胞凋亡，探索Dickkopf-I與 細(xì)胞凋亡在SANFH中的作用。
[0006] 進(jìn)一步，Dickkopf-I與細(xì)胞凋亡在激素性股骨頭缺血性壞死中作用的研究方法的 具體步驟如下：
[0007] 步驟一、收集全髖置換手術(shù)后取下的股骨頭，-80°C冰箱保存。SANHl例作為實(shí)驗(yàn) 組，新鮮股骨頸骨折標(biāo)本作為對(duì)照組，對(duì)照組患者排除心血管及免疫系統(tǒng)疾患，無(wú)煙酒嗜好 及服用激素史；
[0008] 步驟二、標(biāo)本制作：
[0009] 將取下的股骨頭自冠狀面對(duì)半剖開，切取股骨頭軟骨骨塊，用4%多聚甲醛固定 12小時(shí)（含0. 1 % DEPC)后，13%乙二胺四乙酸（EDTA PH7.0)脫鈣，脫鈣完全后，常規(guī)石蠟 包埋；
[0010] 步驟三、光鏡下組織形態(tài)學(xué)觀察：
[0011] 取石蠟包埋組織塊，制成厚5 μπι切片，HE染色，將染色后的切片分別置于100倍 及400倍光鏡下觀察組織病理學(xué)改變，用空缺骨陷窩率來(lái)表示骨細(xì)胞壞死的病理變化；
[0012] 步驟四、透射電子顯微鏡觀察：
[0013] 在股骨頭壞死區(qū)切取骨塊，2. 5%戊二醛液前固定，10% EDTA脫鈣，1%餓酸后固 定，環(huán)氧樹脂包埋，瑞典LKB2800型制作超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鋁染色，電鏡觀察；
[0014] 步驟五、TUNEL法檢測(cè)骨細(xì)胞凋亡情況；
[0015] 步驟六、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Dickkopf-I ;
[0016] 步驟七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
[0017] 進(jìn)一步，HE染色的具體方法為：
[0018] 第一步、60 °C烤箱脫蠟30分鐘；
[0019] 第二步、二甲苯I脫蠟10分鐘；
[0020] 第三步、二甲苯II脫蠟5分鐘；
[0021] 第四步、無(wú)水乙醇洗去二甲苯2次，每次1分鐘；
[0022] 第五步、95%乙醇2次，每次1分鐘；
[0023] 第六步、90 %乙醇1分鐘；
[0024] 第七步、85 %乙醇1分鐘；
[0025] 第八步、自來(lái)水洗去乙醇5分鐘；
[0026] 第九步、蘇木素著色4分鐘；
[0027] 第十步、自來(lái)水沖1分鐘；
[0028] 第十一步、1 %鹽酸酒精分化20秒；
[0029] 第十二步、自來(lái)水洗1分鐘；
[0030] 第十三步、1 %稀氨水返藍(lán)30秒，蒸餾水洗1分鐘；
[0031] 第十四步、伊紅染色20秒，0、85%酒精脫水20秒；
[0032] 第十五步、90 %酒精脫水30秒；
[0033] 第十六部、95 %酒精脫水1分鐘；
[0034] 第十七步、95 %酒精脫水1分鐘；
[0035] 第十八步、無(wú)水乙醇I脫水2分鐘；
[0036] 第十九步、無(wú)水乙醇II脫水2分鐘；
[0037] 第二十步、二甲苯I 2分鐘；
[0038] 第二^^一步、二甲苯II 2分鐘；
[0039] 第二十二步、二甲苯III 2分鐘；
[0040] 第二十三步、中性樹膠封片。
[0041] 進(jìn)一步，TUNEL法檢測(cè)骨細(xì)胞凋亡情況的具體方法為：
[0042] 第一步、標(biāo)本的處理：（a)玻片預(yù)先用APES進(jìn)行處理；(b)細(xì)胞涂片和冰凍切片： 必須馬上固定，用4%的多聚甲醛PH為7. 0-7. 6，在室溫固定35分鐘，0. 0IM PBS液洗2次， 每次2分鐘，蒸餾水洗滌2次每次2分鐘。（c)組織：立刻固定，10%中性緩沖甲醛液固定5 小時(shí)，石蠟包埋，切片脫蠟干凈后入水；
[0043] 第二步、制備新鮮的3 %的H2O2，在室溫下處理10分鐘，蒸餾水洗滌3次，每次2分 鐘；
[0044] 第三步、標(biāo)本片加0· OlM TBS 1 : 200的新鮮稀釋Proteinase K 37°C消化15分 鐘，0.0 lM的TBS液洗3次，每次2分鐘；
[0045] 第四步、每張標(biāo)本片加標(biāo)記緩沖液20 μ 1，以防止切片干燥，將TdT和DIG-d-UTP各 1 μ 1與18 μ 1標(biāo)記緩沖液混和滴與切片上。甩掉其上多余的液體再滴標(biāo)記液，每片20 μ 1。 將樣品放在37°c濕盒里2小時(shí)；
[0046] 第五步、0.0 lM的TBS液洗滌3次，每次2分鐘；
[0047] 第六步、每片滴封閉液50 μ 1，室溫下30分鐘后，甩去封閉液；
[0048] 第七步、將1 : 100的抗體稀釋液稀釋生物素化抗地高辛抗體，混勻，每片標(biāo)本滴 50 μ 1，放在37°C濕盒里反應(yīng)30分鐘，用0.0 lM TBS洗滌3次，每次2分鐘；
[0049] 第八步、用抗體稀釋液1 : 100稀釋SABC :將SABC 10 μ 1加入1ml的抗體稀釋液， 混勻，每片滴50 μ 1。37°C反應(yīng)30分鐘，0. 0IM TBS洗滌4次每次5分鐘；
[0050] 第九步、DAB顯色：在DAB試劑盒的A、B、C試劑中各加入一滴蒸餾水，混勻，滴到標(biāo) 本片上，顯色20分鐘，顯微鏡下觀察著色情況后水洗；
[0051] 第十步、蘇木素輕度復(fù)染；0.0 lM TBS洗，蒸餾水洗；脫水，透明，封片；光學(xué)顯微鏡 下觀察且記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；TUNEL染色，當(dāng)細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒的為陽(yáng)性細(xì)胞，即為凋亡 的細(xì)胞；在光鏡下，隨機(jī)在每張玻片上找5個(gè)高倍視野，每個(gè)高倍視野下計(jì)數(shù)50個(gè)骨細(xì)胞，