一種汞-IgM螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種汞-IgM螯合物及其制備方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 血清中IgM是由5個單體通過一個J鏈和二硫鍵連接成五聚體，分子量最大，為 970kD，沉降系數(shù)為19S，稱為巨球蛋白（maHgoglobulin)。在分子結(jié)構(gòu)上IgM無鉸鏈區(qū)，C μ 2 可能替代了鉸鏈區(qū)的功能。在生物進化過程中IgM是最早出現(xiàn)的免疫球蛋白。在個體發(fā)育 過程中，無論是B細(xì)胞膜表面Ig(SmIg)，還是合成分泌到血清中的Ig，IgM都是最早出現(xiàn)的 Ig，在胚胎發(fā)育晚期的胎兒即有能力產(chǎn)生IgM。在抗原刺激誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答過程中，一般 IgM也最先產(chǎn)生。IgM占血清總Ig的5%~10%。由于IgM在免疫應(yīng)答早期產(chǎn)生，并在補體 參與下的溶血作用比IgG強500倍以上，而且活化補體后通過C3b、C4b等片段發(fā)揮調(diào)理作 用，因此IgM在機體的早期免疫防護中占有重要地位。天然的血型抗體（凝集素）為IgM， 血型不符的輸血，易發(fā)生嚴(yán)重的溶血反應(yīng)。IgM不能過胎盤，臍血中如出現(xiàn)針對某種病原微 生物的IgM，表示胚胎期有相應(yīng)病原微生物如梅毒螺旋體、風(fēng)疹或巨細(xì)胞毒等感染，稱為胚 胎感染或垂直感染。正常人血清中也含有產(chǎn)量單體IgM。
[0003] 萊（Mercury，Hg)是一種無處不在的重金屬，廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥業(yè)，是 一種非常重要的環(huán)境污染物。2011年，美國毒物和疾病登記署（United States Agency for Toxic Substances and Disease Registry，ATSDR)已將其列入物質(zhì)優(yōu)先列表內(nèi) (Substance Priority List)，而世界衛(wèi)生組織（World Health 0rganization，WH0)也早已 將其列為10大最易引起健康問題的化學(xué)品之一。在美國，Cr與Hg、Cd、Pb被認(rèn)為是四大環(huán) 境污染物，嚴(yán)重影響著人們的身體健康。常見的汞職業(yè)暴露人群包括從事金屬冶煉、開采金 礦、燒煤、電產(chǎn)業(yè)和木材生產(chǎn)的人群，而對于普通人群主要通過食入汞污染的海鮮、飲入汞 污染水源、吸入燃料燃燒或蒸發(fā)的汞蒸氣。此外，含汞化妝品的接觸、填充汞合金牙科填充 物、接觸疫苗防腐劑中的乙基汞、含汞殺蟲劑的接觸都是常見的汞暴露方式，汞與人們的生 活密切相關(guān)。2009年，國家健康與營養(yǎng)測試調(diào)查中發(fā)現(xiàn)（National Health and Nutrition Examination Study, NHANES)，2%的美國育齡期婦女體內(nèi)的汞都超標(biāo)。汞被認(rèn)為是對人體 及其有害的，會影響人體的多個組織、器官及系統(tǒng)，包括心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、 內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等，對人體危害極大。
[0004] 目前可以運用多種方法檢測出血汞含量，包括ELISA、原子吸收光譜（Atomic Absorption Spectroscopy，AAS)定量檢測法、電感親合等離子體質(zhì)譜儀（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)定量檢測法等，但仍存在一定缺陷。
[0005] 關(guān)于汞中毒，特別是慢性汞中毒的評價，僅能通過檢測血汞含量，間接反應(yīng)人體內(nèi) 的循環(huán)汞含量，無法進一步評估汞對于機體功能的損傷程度，而隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展， 汞與人體的關(guān)系也日益緊密，因而尋找一種可以從機體功能角度評價汞中毒，特別是慢性 汞中毒對于機體的損害程度的評價方式日益重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對汞污染嚴(yán)重的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種汞-IgM螯合物及其制備方 法，并建立萊-IgM螯合物的定性、定量檢測方法，以便定量檢測萊-IgM螯合物在評價一個 地區(qū)汞污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個地區(qū)人群血清中汞-IgM螯合物可以間接反映 這個地區(qū)人群受汞污染的情況，從而間接反映這個地區(qū)汞污染程度。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：提供一種汞-IgM螯合物，汞離子與 IgM通過巰基或/和半胱氨酸殘基螯合而成。
[0008] 本發(fā)明還提供一種上述的汞-IgM螯合物的制備方法，包括以下步驟：
[0009] A)汞與IgM的螯合反應(yīng)：在人源的IgM中加入汞離子進行螯合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶 液；
[0010] B)純化汞-IgM螯合物的提?。翰捎妹庖哂H和層析法，去除反應(yīng)溶液中未反應(yīng)的 IgM以及多余的汞離子，即得汞-IgM螯合物。
[0011] 其中，體外合成法中所述步驟B)具體如下：
[0012] (1)溶解樣品：向經(jīng)過步驟A)得到的反應(yīng)溶液中加入生理鹽水，使汞-IgM螯合物 復(fù)溶；
[0013] (2)平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與IgM特 異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0014] (3)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，IgM與 填料特異性結(jié)合；
[0015] (4)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0. lmol/L的磷 酸鹽溶液進行洗脫；
[0016] (5)收集：收集經(jīng)過步驟（4)洗脫后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性；
[0017] (6)透析：將步驟（5)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0018] (7)平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與汞特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0019] (8)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟(6)中樣本，然后上柱；
[0020] (9)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的磷 酸鹽溶液進行洗脫；
[0021] (10)收集：收集經(jīng)過步驟（9)洗脫后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性；
[0022] (11)透析：將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三 次后，4°C透析過夜，收集樣本，即得汞-IgM螯合物。
[0023] 其中，上述汞-IgM螯合物的制備方法，還包括步驟C):對汞-IgM螯合物的鑒定；
[0024] 其中，步驟C)中具體如下：
[0025] (1)制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[0026] (2)加樣：取步驟B)中提取純化得到的汞-IgM螯合物，加入稀釋緩沖液，并混勻， 然后加樣于樣品槽中；
[0027] (3)電泳：連接電泳板，進行電泳；
[0028] (4)檢測：在膠床上找出含汞的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶復(fù)溶， 然后再采用ICP-MS法、AAS法或ELISA法檢測是否含有汞以及檢測汞的含量。
[0029] 本發(fā)明還提供一種如上述的汞-IgM螯合物在制備檢測人體內(nèi)汞-IgM螯合物的試 劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的汞-IgM螯合物作為對照品的試劑盒。
[0031] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有可捕獲IgM的蛋白或捕獲金屬 汞的物質(zhì)。
[0032] 本發(fā)明還提供一種定量檢測汞-IgM螯合物的方法，以已知含量的上述的汞-IgM 螯合物作為對照品，采用以下方法之一對樣品進行檢測：酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收 光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純汞-IgM螯合物與酶聯(lián)免疫結(jié) 合法、提純汞-IgM螯合物與原子吸收光譜結(jié)合法、提純汞-IgM螯合物與電感耦合等離子體 質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0033] 實施本發(fā)明的汞-IgM螯合物及其制備方法和應(yīng)用，具有以下有益效果：
[0034] 1.本發(fā)明首次體外合成汞-IgM螯合物；
[0035] 2.本發(fā)明首次提出汞-IgM螯合物可用于制備檢測血樣中汞-IgM螯合物的試劑或 試劑盒中的應(yīng)用。
[0036] 3.本發(fā)明建立了汞-IgM螯合物的定性定量檢測方法，以便定量檢測汞-IgM螯合 物在評價一個地區(qū)汞污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個地區(qū)人群血清中汞-IgM螯合物 可以間接反映這個地區(qū)人群受汞污染的情況，從而間接反映這個地區(qū)汞污染程度。本發(fā)明 建立的汞-IgM螯合物定量檢測方法其準(zhǔn)確度大大提高，并且使檢測的重復(fù)性得到大大提 尚。
【附圖說明】
[0037] 圖1為本發(fā)明所述的汞-IgM螯合物的非變性電泳條帶圖；
[0038] 圖2為本發(fā)明所述的汞-IgM螯合物的同步輻射X線電泳條帶的熒光分析圖；
[0039] 其中，圖1中，M為Marker，2為汞-IgM螯合物；圖2中，橫坐標(biāo)為蛋白條帶位置， 縱坐標(biāo)為該蛋白條帶中汞金屬能量。
【具體實施方式】
[0040] 下面，結(jié)合【具體實施方式】，對本發(fā)明做進一步描述：
[0041] 本發(fā)明除特別說明外，涉及的實驗操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟，所用試劑、材 料如下述所列舉，在本發(fā)明中沒有列舉出來的均為本領(lǐng)域常用的試劑或可以通過市購方式 獲得：
[0042] 提取試劑為PEG溶液、硼酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0043] 膠床介質(zhì)為瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種；
[0044] 本發(fā)明中的所述能與IgM特異性結(jié)合的填料，為表面附有表面附有能捕獲IgM的 蛋白的硅膠或樹脂；
[0045] 本發(fā)明中的能捕獲IgM的蛋白（抗IgM抗體），包括但不限于兔Anti-人類IgM H&L，其品牌為Abeam、型號為ab8505 ;
[0046] 本發(fā)明中的能與汞特異性結(jié)合的填料，為表面附有表面附有能捕獲汞的物質(zhì)的硅 膠或樹脂；
[0047] 本發(fā)明中的能捕獲汞的物質(zhì)，包括但不限于鼠抗Hg mAb，購買自巴傲德生物技術(shù) 公司（BioWorld Inc)、貨號為 AP7014;
[0048] 酶標(biāo)抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種；
[0049] 底物為甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液；
[0050] 洗滌液為含有 KH2PO4 0· 2mg/ml、Na2HPO4 · 12H20 2. 90mg/ml、NaCl 8. Omg/ml、KCl 0· 2mg/ml、0. 5% Tween-20 的 pH 為 7· 4 的 0· 15M PBS 溶液；
[0051] 封閉液為1% -5