苯胺（TMB)溶液；
[0048] 洗滌液為含有 KH2PO4O. 2mg/ml、Na2HPO4 · 12H20 2. 90mg/ml、NaC18. Omg/ml、KCl 0· 2mg/ml、0. 5% Tween-20 的 pH 為 7. 4 的 0· 15M PBS 溶液；
[0049] 封閉液為I % -5 %牛血清白蛋白或脫脂奶粉；
[0050] 稀釋緩沖液為含 I. 5mg/mL Na2C03、2. 93mg/ml NaHCO3的 PH 為 9. 6 的 0· 05M 碳酸 鹽緩沖液；
[0051 ] 酶標抗體為HRP酶標抗體；
[0052] 終止液為：將21. 7ml的2M H2SO4定容至200ml的ddH 20中；
[0053] 洗脫液為含木瓜蛋白酶的PH為8. 0的0. lmol/L Tris-HCL緩沖液；
[0054] 酸化劑為硝酸；
[0055] 上樣緩沖液為含有 IM Tris-HCl (pH 6. 8) 15. 5mL、1 %溴酚藍 2. 5mL、ddH207mL、甘 氨酸 25mL 的 Sample buffer (5X);
[0056] 電泳緩沖液為含Tris 3mg/ml、甘氨酸14. 4mg/ml的PH為6· 8的ddH20溶液；
[0057] 本發(fā)明提供一種鉻-IgA螯合物，鉻離子與IgA通過巰基或/和半胱氨酸殘基螯合 而成。
[0058] 本發(fā)明還提供一種鉻-IgA螯合物的制備方法，包括以下步驟：
[0059] A)鉻與IgA的螯合反應：在人源的IgA中加入鉻離子進行螯合反應，得到反應溶 液；
[0060] B)純化鉻-IgA螯合物的提取：采用免疫親和層析法，去除反應溶液中未反應的 IgA以及多余的鉻離子，即得鉻-IgA螯合物，具體步驟如下：
[0061] (1)溶解樣品：向經(jīng)過步驟A)得到的反應溶液中加入生理鹽水使鉻-IgA螯合物 復溶；
[0062] (2)平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與IgA特 異性結合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；所述能與IgA特異性結合的填 料為含抗IgA抗體的硅膠或樹脂；
[0063] (3)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，IgA與 填料特異性結合；
[0064] (4)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0. lmol/L的磷 酸鹽溶液進行洗脫，得到洗脫液I ;
[0065] (5)收集：收集洗脫液I ;
[0066] (6)透析：將步驟（5)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0067] (7)平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鉻特異性結合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；所述能與鉻特異性結合的填 料為含抗鉻抗體的硅膠或樹脂；
[0068] (8)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟(6)中樣本，然后上柱；
[0069] (9)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的磷 酸鹽溶液進行洗脫，得到洗脫液II ;
[0070] (10)收集：收集洗脫液II ;
[0071] (11)透析：將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用2升CldH2O透析除鹽，換 水三次后，4°C透析過夜，收集樣本，即得鉻-IgA螯合物；
[0072] C)對鉻-IgA螯合物的鑒定，具體步驟如下：
[0073] (1)制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質制備膠床；
[0074] (2)加樣：取步驟B)中提取純化得到的鉻-IgA螯合物，加入稀釋緩沖液，并混勻， 然后加樣于樣品槽中；
[0075] (3)電泳：連接電泳板，進行電泳；
[0076] (4)檢測：在膠床上找出含鉻的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法檢測是否含有鉻以及檢測鉻的含量。
[0077] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的鉻-IgA螯合物作為標準品的試劑盒。
[0078] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲IgA的物質或捕獲鉻的物 質。
[0079] 在本發(fā)明中，能實現(xiàn)本發(fā)明目的的試劑盒可以列出以下幾種，但并不限于此。
[0080] -種檢測血樣中鉻-IgA螯合物的試劑盒，包括含有捕獲IgA的物質的包被液、封 閉液、洗滌液、作為二抗的可捕獲鉻的物質、酶標抗體、底物、終止液、稀釋緩沖液、陽性對 照、陰性對照等。
[0081] -種檢測血樣中鉻-IgA螯合物的試劑盒，包括含有捕獲IgA的物質的包被液、封 閉液、洗滌液、洗脫液、陽性對照、陰性對照等。
[0082] -種檢測血樣中鉻-IgA螯合物的試劑盒，包括含有捕獲IgA的物質的包被液、封 閉液、洗滌液、洗脫液、酸化劑、過氧化氫、陽性對照、陰性對照等。
[0083] -種檢測血樣中鉻-IgA螯合物的試劑盒，包括作為提純血漿中IgA所需提取試 劑、復溶液、含有捕獲鉻的物質的包被液、封閉液、洗滌液、酶標抗體、底物、終止液、稀釋緩 沖液、陽性對照、陰性對照等。
[0084] -種檢測血樣中鉻-IgA螯合物的試劑盒，包括作為提純血漿中IgA所需提取試 劑、復溶液、陽性對照、陰性對照等。
[0085] -種檢測血樣中鉻-IgA螯合物的試劑盒，包括作為提純血漿中IgA所需提取試 劑、復溶液、酸化劑、過氧化氫、陽性對照、陰性對照等。
[0086] -種檢測血樣中鉻-IgA螯合物的試劑盒，包括作為提純血漿中IgA的提取試劑、 膠床介質、復溶液、上樣緩沖液、溶解膠床上含鉻的蛋白條帶所需液體、含有捕獲鉻的物質 的包被液、封閉液、洗滌液、酶標抗體、底物、終止液、稀釋緩沖液、陽性對照、陰性對照等。
[0087] -種檢測血樣中鉻-IgA螯合物的試劑盒，包括作為提純血漿中IgA所需提取試 劑、膠床介質、復溶液、上樣緩沖液、溶解膠床上含鉻的蛋白條帶所需液體、陽性對照、陰性 對照等。
[0088] -種檢測血樣中鉻-IgA螯合物的試劑盒，包括作為提純血漿中IgA所需提取試 劑、膠床介質、復溶液、上樣緩沖液、溶解膠床上含鉻的蛋白條帶所需液體、酸化劑、過氧化 氫、陽性對照、陰性對照等。
[0089] 上述幾種試劑盒中，所述陽性對照為標準品，即螯合有重金屬鉻的IgA螯合物或 螯合有重金屬鉻的BSA螯合物；所述陰性對照為不含有標準品的稀釋緩沖液。
[0090] 上述試劑盒用于檢測螯合鉻的IgA，以提高檢測的準確性，重復性，并使之在臨床 中得到推廣。
[0091] 本發(fā)明還提供一種定量檢測鉻-IgA螯合物的方法，以已知含量的上述的鉻-IgA 螯合物作為標準品，采用以下方法之一對樣品進行檢測：酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收 光譜結合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質譜結合法、提純鉻-IgA螯合物與酶聯(lián)免疫結 合法、提純鉻-IgA螯合物與原子吸收光譜結合法、提純鉻-IgA螯合物與電感耦合等離子體 質譜結合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感耦合等離子體質譜結合法。在本發(fā)明 中，用檢測鉻-IgA螯合物的方法可以列出的有以下幾種，但并不限于以下幾種。
[0092] 其中，上述定量檢測鉻-IgA螯合物的方法中采用的試劑如下：
[0093] 方法一：酶聯(lián)免疫法(ELISA法）檢測鉻-IgA螯合物，按照如下步驟檢測：
[0094] 1)將能夠捕獲IgA的物質，如抗IgA抗體（抗IgA Ab)包被于固相載體上：用稀釋 緩沖液將抗IgA Ab至稀釋500-4000倍，加入ELISA板微孔中，4°C過夜16-18小時，或37°C 水浴1-3小時，儲存冰箱；
[0095] 2)從循環(huán)系統(tǒng)取血衆(zhòng)，作待檢樣品，1000 rmp離心5-8分鐘，離心棄去沉淀；
[0096] 3)封閉：移去稀釋緩沖液，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加入以1% -5% 牛血清白蛋白或脫脂奶粉作為封閉液，37°C放置1小時，移去封閉液，并用洗滌液進行洗 滌，洗滌完成后，ELISA板于36. 5-37. 5°C放置1-2小時；
[0097] 4)加待檢樣品，并且溫育：加入步驟2)中的待檢樣品、以已知含量的鉻-IgA螯合 物作標準品；用稀釋緩沖液將待檢樣品稀釋至10-40倍，加入微孔中，37°C作用1-2小時；
[0098] 5)加入可以捕獲鉻的物質，并且溫育：移去待檢樣品，并用洗滌液進行洗滌，待洗 滌完成后，加入用稀釋緩沖液稀釋至5000-40000倍的抗Cr Ab，37°C作用1-2小時，使抗Cr Ab與IgA上的金屬絡反應形成抗原抗體復合物；
[0099] 6)酶結合物溫育：移去抗鉻抗體，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加入用稀 釋緩沖液稀釋的酶標抗體，使稀釋的酶標抗體的濃度為2 μ g/mL，37°C作用1-2小時，使其 與酶標抗體反應；
[0100] 7)底物溫育：移去酶標抗體，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加入底物， 37°C避光作用30分鐘；
[0101] 8)終止反應：將終止液滴加至每一微孔；
[0102] 9)取波長405nm，加完終止液后，將ELISA板置于酶標儀上檢測，分別讀取待檢樣 品和標準品的OD值，通過繪制標準曲線，求得待檢樣品的含量（也可不使用酶標儀，直接通 過顯色情況進行定性檢測）。
[0103] 該方法利用ELISA原理，可以將血漿中的特異性IgA提取出來，提取出來的IgA上 部分螯合有重金屬鉻，而這部分IgA上的鉻被抗鉻抗體所捕獲，之后可以再被辣根過氧化 物酶、堿性磷酸酶等酶標記的抗體所捕獲（該抗體不識別包被蛋白），捕獲上的抗體在顯色 劑及終止液的作用下，可以在儀器下讀出OD值，而不含有螯合金屬鉻的IgA，則不會被抗鉻 的特異性抗體所捕獲，也不會與辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標記的抗體所捕獲，而所 用試劑中也不含有金屬鉻（陰性對照組結果為陰性），因而當所讀取的OD值結果顯示為陽 性時，即可證明檢測出IgA上螯合的金屬鉻。
[0104] 方法二：酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結合法(ELISA法+AAS法）檢測鉻-IgA螯合物 按照如下步驟檢測：
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