一種鎘-高密度脂蛋白螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及重金屬離子的免疫學(xué)檢測，具體涉及一種鎘-高密度脂蛋白螯合物及 其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂蛋白（lipoproteins)是蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合所形成的一種脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù) 合物，按密度分為高密度脂蛋白（high density lipoprotein，簡稱HDL)、中間密度脂 蛋白（intermediate density lipoprotein，簡稱 IDL)、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，簡稱 LDL)、極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein,簡稱 VLDL)、 乳糜顆粒（chylomiCdon，CM)。血液中大約百分之三十的膽固醇是通過高密度脂蛋白從組 織細(xì)胞中運(yùn)輸?shù)礁闻K轉(zhuǎn)化為膽汁酸或通過膽汁排出體外的。高密度脂蛋白由50%的蛋白、 30%的磷脂、25%的膽固醇（其中70%為膽固醇酯）、5%的三酰甘油組成。
[0003] 高密度脂蛋白（簡稱HDL)是血漿中主要脂蛋白之一，其密度最高，顆粒直徑最小， 蛋白和脂質(zhì)含量大致均等的異質(zhì)性脂蛋白。由50%的蛋白、30%的磷脂、25%的膽固醇（其 中70%為膽固醇酯）、5%的三酰甘油組成。
[0004] HDL是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的主要脂類保護(hù)因素，其在血清蛋白中有很強(qiáng)的 抑制動(dòng)脈粥樣硬化作用，是冠狀動(dòng)脈疾病的重要保護(hù)因子，與冠心病危險(xiǎn)程度呈負(fù)相關(guān)。
[0005] 鎘是一種常見的有毒金屬及環(huán)境污染物，廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中，包括電鍍、 制造工業(yè)顏料、塑料穩(wěn)定劑、鎳鉻電池等，與人們生活息息相關(guān)。對于普通人群，主要是通 過吸入鎘污染的空氣，及食用含鎘污水灌溉農(nóng)田生產(chǎn)的農(nóng)作物（如含鎘大米）等方式攝入 鎘。研究表明，鎘是一種全身性毒物，可引起人和動(dòng)物的肺、肝、腎等多種器官以及心血管、 免疫、神經(jīng)等多系統(tǒng)功能損傷，還具有較強(qiáng)的致癌作用。1993年國際腫瘤研究機(jī)構(gòu)（IARC) 已將鎘及其化合物列為第1類人致癌物?？梢婃k對機(jī)體的影響及其重要，不可忽視。
[0006] 目前已有大量的文獻(xiàn)證實(shí)鎘可以作用于全身各個(gè)系統(tǒng)中的蛋白，從而影響機(jī)體各 組織器官的機(jī)能。眾所周知，高密度脂蛋白是一種特殊意義的蛋白質(zhì)，鎘是否可以作用于高 密度脂蛋白，而使高密度脂蛋白結(jié)構(gòu)改變、含量改變、活性改變、功能改變，這些尚缺乏相關(guān) 研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對鎘污染嚴(yán)重的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種鎘-高密度脂蛋白螯合物及 其制備方法，并建立鎘-高密度脂蛋白螯合物的定性、定量檢測方法，以便定量檢測鎘-高 密度脂蛋白螯合物在評價(jià)一個(gè)地區(qū)鎘污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個(gè)地區(qū)人群血清中 鎘-高密度脂蛋白螯合物，可以間接反映這個(gè)地區(qū)人群受鎘污染的情況，從而間接反映這 個(gè)地區(qū)鎘污染程度。
[0008] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：提供一種鎘-高密度脂蛋白螯合 物，該鎘-高密度脂蛋白螯合物是鎘離子與高密度脂蛋白通過巰基或/和半胱氨酸殘基螯 合而成。
[0009] 本發(fā)明還提供一種上述的鎘-高密度脂蛋白螯合物的制備方法，即體外合成法， 包括以下步驟：
[0010] A)鎘-高密度脂蛋白的合成：在提純源于人體的高密度脂蛋白或按照生物學(xué)方法 重組的高密度脂蛋白中加入鎘離子進(jìn)行螯合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；
[0011] B)鎘-高密度脂蛋白螯合物純化：采用免疫親和層析法，去除步驟A)反應(yīng)溶液中 未反應(yīng)的高密度脂蛋白、特異性抗體和鎘離子，即得鎘-高密度脂蛋白螯合物。
[0012] 作為優(yōu)選，所述步驟B)中具體包括以下步驟：
[0013] (1)溶解樣品：將上述步驟A)的提取的鎘-高密度脂蛋白螯合物溶解于生理鹽水 中，得鎘-高密度脂蛋白螯合物溶液；
[0014] (2)平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與高密 度脂蛋白特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0015] 所述能與高密度脂蛋白特異性結(jié)合的填料為吸附有可與高密度脂蛋白特異性結(jié) 合物質(zhì)的硅膠或樹脂；
[0016] (3)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)所述溶液，然后上柱，使高 密度脂蛋白與填料特異性結(jié)合；
[0017] (4)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0. lOmol/L的 Na2HP0j§液進(jìn)行洗脫；
[0018] (5)收集：收集步驟（4)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原；
[0019] (6)透析：將步驟（5)中的收集的洗脫液裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0020] (7)平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鎘特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0021] 所述能與鎘特異性結(jié)合的填料為吸附有可與鎘特異性結(jié)合物質(zhì)的硅膠或樹脂；
[0022] (8)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟(6)中樣本，然后上柱；
[0023] (9)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的 Na2HP0j§液進(jìn)行洗脫；
[0024] (10)收集：收集步驟（9)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原；
[0025] (11)透析：將步驟（10)的洗脫液裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次后，4°C透 析過夜，收集樣本，即得鎘-高密度脂蛋白螯合物。
[0026] 作為優(yōu)選，上述鎘-高密度脂蛋白螯合物的制備方法，還包括以下對鎘-高密度脂 蛋白螯合物的鑒定步驟，具體包括以下步驟：
[0027] (1)制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[0028] (2)加樣：取步驟B)中提取純化得到的鎘-高密度脂蛋白螯合物，加入上樣緩沖 液，并混勻，然后加樣于樣品槽中；
[0029] (3)電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳；
[0030] (4)檢測：在膠床上找出含鎘的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶溶解， 然后再采用ICP-MS或AAS檢測是否含有鎘以及檢測鎘的含量。
[0031] 本發(fā)明還提供一種如上述的鎘-高密度脂蛋白螯合物在制備檢測人體內(nèi)鎘-高密 度脂蛋白螯合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0032] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的鎘-高密度脂蛋白螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的試 劑盒。
[0033] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲高密度脂蛋白的物質(zhì)或捕 獲金屬鎘的物質(zhì)。
[0034] 本發(fā)明還提供一種定量檢測鎘-高密度脂蛋白螯合物的方法，以已知含量的上述 的鎘-高密度脂蛋白螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用以下方法之一對樣品進(jìn)行檢測：酶聯(lián)免疫法、 酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純鎘-高 密度脂蛋白螯合物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法、提純鎘-高密度脂蛋白螯合物與原子吸收光譜結(jié)合 法、提純鎘-高密度脂蛋白螯合物與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原 子吸收光譜或電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0035] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0036] 1.本發(fā)明首次合成了鎘-高密度脂蛋白螯合物；
[0037] 2.本發(fā)明首次提出鎘-高密度脂蛋白螯合物可用于制備檢測血樣中鎘-高密度脂 蛋白螯合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用；
[0038] 3.本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了 -高密度脂蛋白螯合物的特異性識別和定量檢測，以便定量檢測 人群血清中鎘-高密度脂蛋白螯合物的含量，以評價(jià)一個(gè)地區(qū)鎘污染程度的應(yīng)用，為工業(yè) 地區(qū)的鎘污染水平提供間接指標(biāo)。本發(fā)明建立的鎘-高密度脂蛋白螯合物定量檢測方法的 準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好。
【附圖說明】
[0039] 圖1為本發(fā)明所述的鎘-高密度脂蛋白螯合物的非變性電泳條帶圖；
[0040] 圖2為本發(fā)明所述的鎘-高密度脂蛋白螯合物的同步輻射X線電泳條的熒光分析 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0042] 本發(fā)明除特別說明外，涉及的實(shí)驗(yàn)操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟；所用試劑、材 料如未特殊說明，均視為可從市購方式購得：
[0043] 提取試劑為PEG溶液、硼酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0044] 捕獲高密度脂蛋白的物質(zhì)為抗高密度脂蛋白抗體，可通過市售獲得，如艾博抗 (上海）貿(mào)易有限公司出售的"Abeam abl57595"的anti-HDL抗體，以下實(shí)施方式中，所述 與高密度脂蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗高密度脂蛋白抗體、抗HDL抗體均為捕獲高密度脂 蛋白的物質(zhì)；
[0045] 酶標(biāo)抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種；
[0046] 稀釋緩沖液為pH 9. 6的0. 05M碳酸鹽緩沖液，配制方法示例：取I. 5g的Na2COjP 2. 93g 的 NaHCO3溶解加 CldH2O 定容至 1000 mL ;
[0047] 洗滌緩沖液為ρΗ7· 4的0· 15M PBS溶液，配制方法示例：取0· 2g的ΚΗ2Ρ04、2. 90g 的 Na2HPO4 · 12Η20、8· Og 的 NaCl、0. 2g 的 KC1、0. 5mLTween-20,溶解加 ddH20 定容至 1000 mL ;
[0048] 封閉液為牛血清白蛋白溶液，配制方法示例：取0.1 g牛血清白蛋白，加入洗滌緩 沖液稀釋定容至IOOmL ;
[0049] 終止液為2M H2SO4,配制方法示例：取178. 3mL的ddH20,加濃H2SO4定容至200mL ;
[0050] 底物為甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液，配制方法示例：取0. 5mL濃度為2g/L的甲基聯(lián)苯 胺乙醇溶液，加底物稀釋液稀釋至IOmL ;
[0051] 底物緩沖液pH為5. 0，其中Na2HPO4的摩爾濃度為0. 2M、檸檬酸的摩爾濃度為 0. 1M，配制方法示例：取I. 42gNa2HP04、0. 96g檸檬酸，然后加入CldH2O至50mL，即得；
[0052] 洗脫液的配制方法示例：將木瓜蛋白酶用pH 8. 0, (λ lmol/L Tris-HCI緩沖液配 制成l-2mg/mL，再加入lmmol/L二硫蘇糖醇（DTT)37°C孵育30min，得洗脫液；
[0053] 上樣緩沖液可由如下比例的組分配制而成=Tris-HCl :1%溴酚藍(lán)：ddH20 :甘氨酸 =15. 5 :2· 5 :7 :25,其中 Tris-HCl 的 pH 為 6. 8、摩爾濃度為