一步放大法熒光檢測汞離子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一步放大法熒光檢測汞離子的方法，屬于檢測用熒光技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 汞及其化合物對人體健康存在多種危害，若存在于天然水體中，則會對大范圍的 人群造成威脅。它能夠在生物體中積累，通過生物鏈轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)，人體內(nèi)積累的微量汞， 人體內(nèi)積累的微量汞無法通過自身代謝進行排泄，將直接導(dǎo)致心臟、肝、甲狀腺疾病，引起 神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，慢性汞中毒，甚至引發(fā)惡性腫瘤的形成。
[0003] 溶解態(tài)的汞離子往往具有較高的化學(xué)活性，是排入天然水體中汞污染物的主要存 在形式，其化合物具有較高的水溶性，也是各種汞形態(tài)轉(zhuǎn)化的樞紐。因此，確立一個靈敏的 高選擇性的方法診斷和在水樣分析中檢測汞離子的含量是至關(guān)重要的。檢測汞離子的方法 主要有分光光度法、原子發(fā)射光譜法、原子吸收光譜法等，然后這些方法存在儀器昂貴、分 析周期長、樣品預(yù)處理復(fù)雜等缺點，難以適應(yīng)汞離子檢測的方便、快捷、靈敏度等方面的需 要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決以上問題，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為汞離子的特異性檢測提供了有利條 件。本發(fā)明基于汞離子可以穩(wěn)定DNA中T-T錯配的原理實現(xiàn)汞離子的檢測，基本原理是：汞 離子的存在可以穩(wěn)定ss-DNA序列中的T-T錯配，使ss-DNA形成相對穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。而 汞離子不存在則無法形成雙鏈結(jié)構(gòu)。
[0005] 本發(fā)明是通過以下步驟得到的： 本發(fā)明中一共用到三條鏈：兩條probe鏈：probel和probe2, 一條發(fā)夾鏈：HAP。兩條 probe鏈的一端分別修飾有poly-T結(jié)構(gòu)，用來與目標(biāo)物汞離子結(jié)合；發(fā)夾上設(shè)置一個酶切 位點，發(fā)夾兩端修飾有熒光基團和猝滅基團。
[0006] Probel :5, -CTT CTT CTT CTT CTTGAT GTT GA-3'（SEQ ID NO:1); Probe2 :5' - GCT GAG GA TTG TTG TTG TTG TTG-3' (SEQ ID NO:2); HAP :5' -GGG CCT CAT TTT TTT TTC AAC ATC CCT CAG CGC TGA GGC CC-3' （SEQ ID N0:3)〇
[0007] 其中Probel與HAPl中畫橫線部分的T之間可特異性結(jié)合汞離子，從而形成 " T-Hg2 +-T "結(jié)構(gòu)。HAP的3 '端修飾FAM發(fā)光基團，5 '端修飾Dabcy 1猝滅基團，沒有目標(biāo)物 汞離子時，發(fā)夾未被打開，猝滅基團Dabcyl將發(fā)光基團FAM猝滅；目標(biāo)物存在時，發(fā)夾被打 開，發(fā)光基團FAM發(fā)光，可用熒光儀檢測熒光強度。本文中用到了一種酶：Nt. BbvCI。這是 一種限制性內(nèi)切酶，它識別雙鏈，但只在一條鏈上進行切割。對單鏈沒有切割。
[0008] 本發(fā)明中汞離子的檢測是用熒光儀實現(xiàn)的，通過一步循環(huán)的方式來實現(xiàn)信號放 大，從而實現(xiàn)汞離子的高靈敏快速檢測，并具有良好的特異性。
[0009] 均相中發(fā)生的反應(yīng)主要有：在有目標(biāo)物存在的情況下，Probel與Probe2中T堿 基之間會由目標(biāo)物連接形成"T-Hg2+-T"結(jié)構(gòu)，從而使Probel與Probe2的poly-T部分固 定到一起，剩余的部分序列由于拉近了距離，可以與HAP作用形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。此時在內(nèi)切 酶Nt. BbvCI的作用下，將鏈按照酶切位點切開掉下，發(fā)夾打開，猝滅基團與發(fā)光基團分離， 產(chǎn)生熒光。同時釋放游離態(tài)的目標(biāo)物，可再次被利用，從而實現(xiàn)循環(huán)放大，即目標(biāo)物誘導(dǎo)的 Probel循環(huán)放大。
[0010] 在均相反應(yīng)中，循環(huán)放大的反應(yīng)條件為37°C，反應(yīng)時間是2h。
[0011] 所述的制備方法：Probel :Probe2 :HAP物質(zhì)量比為1 :1 :50。
[0012] 所述的制備方法均相部分，是通過以下步驟得到的： (1)在 200ul 離心管中依次放入 8ulH20，Probel 鏈 2ul(0. 5uM)，Probe2 鏈 2ul(0. 5uM)， HAP 鏈 5ul (IOuM)，Nt. BbvCI 的 buffer 2ul，Nt. BbvCI 酶 IOOUml，制成 20ul 均相體系。在 振蕩器上振蕩30s，混合均勻。
[0013] (2)然后將混勻的混合液放入37°C的恒溫箱中孵育2h。
[0014] 所述的制備方法檢測方法，是通過以下步驟得到的： (1) 向混合液中加入180ulH20溶液，混合均勻，形成200ul體系，將其全部置入熒光杯 中，放入熒光儀； (2) 設(shè)置激發(fā)波長為494nm，發(fā)射波長范圍為500nm-630nm，入射狹縫5nm，出射狹縫寬 度為3nm ;開始測試其熒光強度。
[0015] 本發(fā)明的工作原理： 本發(fā)明基于汞離子可以穩(wěn)定DNA中T-T錯配的原理實現(xiàn)汞離子的檢測，基本原理是：汞 離子的存在可以穩(wěn)定ss-DNA序列中的T-T錯配，使ss-DNA形成相對穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。而 汞離子不存在則無法形成雙鏈結(jié)構(gòu)。
[0016] 本發(fā)明中一共用到三條鏈：兩條probe鏈：probe 1和probe2, 一條發(fā)夾鏈：HAP。 兩條probe鏈的一端分別修飾有poly-T結(jié)構(gòu)，用來與目標(biāo)物汞離子結(jié)合；發(fā)夾上設(shè)置一 個酶切位點，發(fā)夾兩端修飾有熒光基團和猝滅基團，在有汞離子的存在下，兩條probe鏈的 poly-T部分與萊離子形成穩(wěn)定的"T-Hg2+-T"結(jié)構(gòu)，probe鏈的剩余部分可以與HAP鏈互補 配對，形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。此時，在內(nèi)切酶的作用下，發(fā)夾沿著酶切位點被酶切成兩條鏈，因此 發(fā)夾被打開，焚光基團與猝滅基團分離，從而產(chǎn)生焚光信號。在沒有目標(biāo)物的時候，HAP鏈 呈現(xiàn)發(fā)夾狀，由于猝滅基團靠近熒光基團，所以不產(chǎn)生熒光。同時，由于發(fā)夾被切斷，原本穩(wěn) 定的結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定，攜帶汞離子的兩條probe鏈游離出來，再次結(jié)合HAP，因此循環(huán)產(chǎn)生 熒光信號。目標(biāo)物汞離子越多，則結(jié)合的Probe鏈越多，結(jié)合的HAP也越多，產(chǎn)生的熒光信 號也就越強，循環(huán)可以放大信號。
[0017] 本發(fā)明的有益效果： 1、 利用了核酸適配體的特異型識別，利用汞離子的適體作為識別物質(zhì)實現(xiàn)了對目標(biāo)物 汞離子的高特異性檢測； 2、 利用內(nèi)切酶的切割作用，實現(xiàn)了目標(biāo)物的循環(huán)利用，起到了信號放大的作用，實現(xiàn)了 對目標(biāo)物的尚敏檢測，提尚了檢測的靈敏度； 3、 檢測原理的主要過程是在均相中實現(xiàn)的，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)速度快； 4、 使用熒光檢測方法的提高了反應(yīng)速度，降低了操作的復(fù)雜程度，實現(xiàn)了目標(biāo)物的快 速，簡單，靈敏的檢測。
【附圖說明】
[0018] 圖1為HAP濃度的優(yōu)化曲線； 圖2為反應(yīng)時間的優(yōu)化曲線； 圖3為內(nèi)切酶濃度的優(yōu)化曲線； 圖4為不同濃度汞離子的熒光強度梯度； 圖5為汞離子濃度其對數(shù)與熒光強度的線性關(guān)系曲線。
【具體實施方式】 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0019] 實施例1 (1)在 200ul 離心管中依次放入 7ulH20，Probe