一種刀豆球蛋白a的測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于化學(xué)發(fā)光技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種刀豆球蛋白A的測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 刀豆球蛋白A(Con A)，又名刀豆凝集素、刀豆素，是一種植物血凝素，具有強(qiáng)力 的促有絲分裂作用，有較好的促淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的作用，其促淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化最適濃度為 40-100 μ g/ml，能沉淀肝糖原，凝集羊、馬、狗、兔、豬、大鼠、小鼠、豚鼠等動(dòng)物及人紅細(xì)胞。 還能選擇性激活抑制性T細(xì)胞（Ts細(xì)胞），對(duì)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)具有重要作用。因此，通過 使用Con A來活化病態(tài)（或老年）時(shí)的Ts細(xì)胞這一途徑，可望改觀一些自身免疫性疾病，甚 或在移植物排斥反應(yīng)或惡性腫瘤的防治方面具有廣泛的應(yīng)用前景。近年來刀豆球蛋白A測(cè) 定方法主要有：凝集抑制試驗(yàn)法（Carrotta R, Vilasi S, Librizzi F, Martorana V，Bulone D, San Biagio PL Entrapment of Aβ l-40peptide in unstructured aggregates. J Phys Chem B 2012,116(50):14700-12707);表面等離子體共振法（Bellapadrona G, Tesler AB, Grilnstein D, Hossain LH, Kikkeri R, Seeberger PH, Vaskevich A, Rubinstein 1.0 ptimization of localized surface plasmon resonance transducers for studying carbohydrate-protein interactions. Anal Chem. 2012,84(1) :232-240);散射光測(cè)定 法（Babu P,Sinha S,Surolia A.Sugar-quantum dot conjugates for a selective and sensitive detection of lectins.Bioconjug Chem. 2007, 18(1) :146-151);等溫滴定 量熱法(Wang X, Matei E, Gronenborn AM, Ramstrom 0, Yan M. Direct measurement of glyconanoparticles and lectin interactions by isothermal titration calorimetry.Anal Chem. 2012,84(10) :4248-4252.);電化學(xué)（Liu BQ，Zhang B, Chen GN, Yang HH, Tang DP.Proximity ligation assay with three-way junction-induced rolling circle amplification for ultrasensitive electronic monitoring of Concanavalin A. Anal Chem. 2014, 86:86, 7773-7781.)等。但是，這些方法的各有其缺點(diǎn)， 本發(fā)明利用磁珠為載體，以異硫氰酸熒光素 FITC為標(biāo)記物，以光誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光原理，實(shí)現(xiàn) 了刀豆球蛋白A的測(cè)定，具有方法簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的是提供一種靈敏的測(cè)定刀豆球蛋白A的新方法，利用磁珠為載體，以 FITC為標(biāo)記物，實(shí)現(xiàn)刀豆球蛋白A的測(cè)定。
[0004] 技術(shù)方案
[0005] 本發(fā)明是基于刀豆蛋白A識(shí)別氨基葡萄糖修飾磁性微球鏈?zhǔn)诫s交反應(yīng)原理測(cè)定 刀豆蛋白A的方法。在目標(biāo)物刀豆蛋白A存在時(shí)，標(biāo)記有不同DNA鏈的磁性微球相互靠 近，磁性微球表面修飾的DNA發(fā)生雜交反應(yīng)，然后，再與修飾有異硫氰酸熒光素 FITC的發(fā)卡 DNA =FITC-Hl和FITC-H2進(jìn)行雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，利用光二極管誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光原理，根據(jù)化學(xué)發(fā) 光強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)對(duì)刀豆蛋白A的測(cè)定。其特征為：
[0006] a.將發(fā)卡DNA在使用之前孵化，然后，逐步降溫至室溫；
[0007] b.取羧基化磁珠至小離心管中，并用Tris-HCl緩沖溶液洗滌兩遍，并分散到 Tris-HCl緩沖溶液中；
[0008] c.將N-(3_(二甲基氨基丙基）-N-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺加 入步驟b中處理好的磁珠溶液中，將該混合物在室溫下輕搖Ih ;
[0009] d.將氨基化葡萄糖水溶液和DNAl加入步驟C所得溶液中，在4°C中條件下，振動(dòng) 12h，反應(yīng)完成后，將所得產(chǎn)物GA-MB-DNAl經(jīng)過磁性分離，并用Tris-HCl緩沖溶液洗滌兩 遍，再分散到Tris-HCl緩沖溶液；
[0010] e.將氨基化葡萄糖水溶液和DNA2加入步驟C所得溶液中，在4°C中條件下，振動(dòng) 12 h，反應(yīng)完成后，將所得產(chǎn)物GA-MB-DNA2經(jīng)過磁性分離，并用Tris-HCl緩沖溶液洗滌兩 遍，再分散到Tris-HCl緩沖溶液；
[0011] f.將GA-MB-DNAl溶液和GA-MB-DNA2溶液混合，然后加入刀豆球蛋白A的樣品溶 液，在37°C下振蕩反應(yīng)30min，反應(yīng)完全后，磁分離，并用磷酸緩沖溶液清洗兩遍，并除去上 清液；
[0012] g.取含有FITC-Hl和FITC-H2的磷酸緩沖溶液加入到步驟f的溶液中，在37°C振 蕩反應(yīng)lh，然后將磁珠用磷酸緩沖溶液清洗兩遍，再將其分散于磷酸緩沖溶液中；
[0013] h.取魯米諾溶液于小燒杯中，并加入步驟g所得磁珠溶液，打開光二極管電源，照 射一段時(shí)間后關(guān)閉電源，然后測(cè)定化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)刀豆球蛋白A的 測(cè)定。
[0014] 測(cè)定具體步驟如下：
[0015] (I) GA-MB-DNAl 和 GA-MB-DNA2 探針的制備
[0016] 實(shí)驗(yàn)中的發(fā)卡DNA在使用之前在95°C下孵化2min，然后，逐步降溫至室溫。
[0017] a.取10 μ L羧基化磁珠至L 5mL小離心管管中，并用100 μ L pH 8. OTris-HCl緩 沖溶液洗滌兩遍，并分散到100 μ L的Tris-HCl緩沖溶液中。
[0018] b.將40mM N-(3-(二甲基氨基丙基）-N-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和IOmM N-羥基琥 珀酰亞胺加入上述處理好的磁珠溶液中，將該混合物在室溫下輕搖lh。
[0019] c.將5 μ L· 30 μ M氨基化葡萄糖水溶液和50 μ L· 5 μ M的DNAl加入上述所得溶液 中。在4°C中條件下振動(dòng)12h。反應(yīng)完成后，將所得產(chǎn)物GA-MB-DNAl經(jīng)過磁性分離，并用 100 μ L pH 8. 0的Tris-HCl緩沖溶液洗滌兩遍，并分散到ImL的Tris-HCl緩沖溶液中。
[0020] d.利用上述C類似的方法，合成氨基化葡萄糖和DNA2修飾的磁珠 GA-MB-DNA2。
[0021] (2)刀豆球蛋白A的測(cè)定
[0022] a.將 100 μ L GA-MB-DNAl 溶液和 100 μ L GA-MB-DNA2 溶液混合，然后加入 100 μ L 刀豆球蛋白A的樣品溶液，在37°C下振蕩反應(yīng)30min。反應(yīng)完全后，磁分離，并用IOOyL PH6. 8的磷酸緩沖溶液清洗兩遍，并除去上清液。
[0023] b.取 100 μ L 含有 1.0 X 10 7M FITC-Hl 和 1.0 X 10 7M FITC-H2 的 pH 6. 8 的磷酸 緩沖溶液加入到上述溶液中中，在37°C振蕩反應(yīng)lh，將磁珠用IOOyL pH 6. 8的磷酸緩沖 溶液清洗兩遍，然后分散于100 μ L pH 6. 8的磷酸緩沖溶液中。
[0024] (3)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)