一種適合于食管鱗狀細(xì)胞癌早期診斷的診斷標(biāo)記物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食管鱗狀細(xì)胞癌的診斷，具體涉及一種食管鱗狀細(xì)胞癌診斷標(biāo)記物， 診斷標(biāo)記物的篩選方法、以該診斷標(biāo)記物為基礎(chǔ)構(gòu)建的診斷模型，以及診斷模型的構(gòu)建方 法，該診斷標(biāo)記物和診斷模型對于食管原位癌、早期和晚期食管癌都具有很好的診斷效果， 特別適合于食管癌早期診斷，屬于食管鱗狀細(xì)胞癌診斷技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 食管癌（esophageal cancer)是由食管鱗狀上皮或腺上皮的異常增生所形成的惡 性病變。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新數(shù)據(jù)表明：全世界每年約有40萬人死于食管癌，我國是食管 癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，且90%患者的組織類型為鱗狀細(xì)胞癌（ESCC)。食管癌發(fā)病 隱匿，早期無癥狀或癥狀很不典型，發(fā)現(xiàn)時(shí)已是臨床晚期，普遍預(yù)后不佳（5年生存率約為 13%)。因此，早期診斷和早期治療是改善食管癌預(yù)后、降低死亡率的關(guān)鍵。目前，在食管 癌高發(fā)區(qū)的早診早治平臺和臨床上常用的早期篩查和診斷方法包括食管拉網(wǎng)細(xì)胞學(xué)檢查、 X線鋇餐造影、食管超聲內(nèi)鏡、食管內(nèi)鏡檢查等。但這些方法均為有創(chuàng)檢查、操作復(fù)雜、且價(jià) 格高昂，限制了其在食管癌篩查和早期診斷中的廣泛應(yīng)用。 食管癌發(fā)生涉及多因素、多階段、多基因變異積累及與環(huán)境因素相互作用的復(fù)雜過程， 包括在分子水平上涉及眾多原癌基因、抑癌基因以及蛋白質(zhì)的改變，以及長期不良的生活 或飲食習(xí)慣的影響（進(jìn)食含亞硝胺類較多的食物、如喜歡腌制酸菜或霉變食品、長期喜進(jìn) 燙食、吸煙、飲酒不良嗜好等）。代謝組學(xué)是對生物樣品（如血清、尿液、唾液等）中所有分 子量低于1000 Da小分子代謝物（如脂肪酸、氨基酸、核苷及留體等生物小分子）進(jìn)行定性 定量檢測，從而監(jiān)測機(jī)體受疾病或危險(xiǎn)因素累積等干擾后內(nèi)源性物質(zhì)做出的代謝響應(yīng)。體 內(nèi)的生物信息由基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄傳遞給蛋白質(zhì)，最終體現(xiàn)為小分子代謝物。不同于基因組學(xué)和 蛋白組學(xué)反映的生物體內(nèi)在差異，代謝組學(xué)的研究領(lǐng)域擴(kuò)展到了機(jī)體與環(huán)境之間的相互影 響和作用。小分子代謝物不僅是機(jī)體生命活動、生化代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)，還體現(xiàn)了某些外來因 素對體內(nèi)代謝環(huán)境的改變，因而某些獨(dú)特代謝物的濃度在不同個(gè)體間的差異事實(shí)上反映了 疾病內(nèi)在的表現(xiàn)和外在病因。近年來研究發(fā)現(xiàn)，諸如代謝性疾病和惡性腫瘤（卵巢癌）等 疾病發(fā)生發(fā)展過程中，機(jī)體基礎(chǔ)生化代謝均發(fā)生了明顯變化，對人類理解復(fù)雜疾病的代謝 機(jī)制將發(fā)揮重要作用，同時(shí)為復(fù)雜疾病的篩檢和早期診斷提供嶄新的技術(shù)方法。
[0003] 食管癌的發(fā)生發(fā)展是由多基因及環(huán)境因素相互作用所致，首先是相關(guān)的功能基 因表達(dá)發(fā)生改變或突變，然后是一系列細(xì)胞信號傳導(dǎo)及蛋白質(zhì)合成改變，最終在與環(huán)境因 素相互作用下使得代謝產(chǎn)物發(fā)生變化。食管癌的發(fā)生正是環(huán)境危險(xiǎn)因素逐漸積累并不 斷損傷機(jī)體各代謝通路穩(wěn)態(tài)的結(jié)果。目前，已經(jīng)有人利用代謝組學(xué)對食管癌進(jìn)行研究， 例如 Wu 等（Wu H, Xue R, Lu C, et al. Metabolomic study for diagnostic model of oesophageal cancer using gas chromatography/mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2009,877(27):3111_7·)、Zhang 等（Zhang J, Bowers J, Liu L,et al. Esophageal cancer metabolite biomarkers detected by LC-MS and NMR methods. PLoS One, 2012, 7(1) :e30181.)、Xu等（Xu J，Chen Y，Zhang R，et al. Global and targeted metabolomics of esophageal squamous cell carcinoma discovers potential diagnostic and therapeutic biomarkers. Mol Cell Proteomics, 2013, 12(5):1306-18.) 都利用代謝組學(xué)技術(shù)對食管癌進(jìn)行了研究。
[0004] 食管癌的發(fā)生發(fā)展伴隨著體內(nèi)多種代謝物的改變，一般需要幾年甚至十幾年，如 能在癌變早期階段發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行早期治療，可有效提高預(yù)后效果。而事實(shí)上，已有研究證明在 疾病發(fā)病前或危險(xiǎn)因素累積階段，內(nèi)源性物質(zhì)就會做出相應(yīng)的代謝響應(yīng)。例如，Zhao等通 過代謝指紋圖譜研究揭示了糖尿病前期患者的代謝特征，并證實(shí)了脂肪酸、色氨酸、尿酸、 膽汁酸等的代謝改變發(fā)生于疾病出現(xiàn)臨床癥狀前很長一段時(shí)間里，為代謝性疾病的篩查、 早期診斷和干預(yù)提供了新的可能。然而，上述食管癌代謝組學(xué)研究納入的主要是食管癌晚 期患者，而大多沒有納入或很少的納入早期食管癌病例。晚期食管癌已發(fā)生淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處 轉(zhuǎn)移，甚至出現(xiàn)腫瘤惡病質(zhì)狀態(tài)，此時(shí)機(jī)體代謝已發(fā)生很大的變化，因此，這些研究僅能發(fā) 現(xiàn)食管癌發(fā)病晚期同健康對照相比的代謝輪廓差異，根據(jù)這些代謝輪廓的差異僅能較好的 診斷出晚期食管癌，而對于早期食管癌卻無法進(jìn)行診斷，即不能實(shí)現(xiàn)食管癌的早期診斷。其 次，上述食管癌代謝組學(xué)研究僅獲得很少一部分與食管癌發(fā)病相關(guān)的代謝物（從研究層次 上僅是代謝靶標(biāo)分析，而不是代謝輪廓或代謝組學(xué)分析）。此外，上述研究大多未從食管癌 的客觀分子篩查/早期診斷標(biāo)準(zhǔn)模型的角度評價(jià)代謝組學(xué)的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)潛力及應(yīng)用效果，大 部分并未報(bào)告篩選的代謝物的篩查/診斷食管癌的靈敏度、特異度以及ROC曲線下面積AUC 值。 發(fā)明人前期針對食管癌已經(jīng)進(jìn)行了一系列研究，采用代謝組學(xué)的技術(shù)研究了能夠進(jìn)行 食管癌早期篩查的代謝組學(xué)分析模型，該技術(shù)對于我國食管癌高發(fā)區(qū)的高危人群發(fā)現(xiàn)具有 的應(yīng)用和推廣價(jià)值，目前已經(jīng)在山東肥城市試點(diǎn)應(yīng)用。然而，食管癌高發(fā)群篩查和臨床早期 診斷仍具有諸多不同。食管癌高發(fā)區(qū)篩查是高發(fā)區(qū)的以健康或表面健康的人為觀察對象， 目的是在健康的人群中發(fā)現(xiàn)那些表面健康，但可疑患有食管部位病變的人（高危個(gè)體），篩 查試驗(yàn)陽性者須作進(jìn)一步的診斷或干預(yù)；而診斷是在臨床環(huán)境下以患者或可疑患者為觀察 對象，目的是區(qū)分患者是否有相應(yīng)病癥，對患者病情做出及時(shí)、正確的判斷，以便采取相應(yīng) 有效的治療措施，臨床上診斷陽性者要給予治療（如手術(shù)、化療或放療）。目前，醫(yī)院普遍使 用有創(chuàng)傷、操作復(fù)雜、且價(jià)格高昂的影像學(xué)檢查臨床診斷食管癌病例，并且患者主動就診是 大多已為晚期，因此仍缺少能簡單有效的用于臨床食管癌診斷（特別是早期食管癌診斷） 的血清生物標(biāo)記物。因此，尋找特異、敏感、經(jīng)濟(jì)和無創(chuàng)的食管癌早期診斷血清代謝標(biāo)記物， 并建立一種安全有效的食管癌早期分子診斷模型具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)中食管鱗狀細(xì)胞癌（簡稱食管癌）的診斷操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴、有 創(chuàng)傷性，目前的標(biāo)記物僅對晚期食管癌靈敏度高，不能實(shí)現(xiàn)食管癌的早期診斷等不足，本發(fā) 明提供了一種適合于食管鱗狀細(xì)胞癌早期診斷的診斷標(biāo)記物，該診斷標(biāo)記物對于食管原位 癌、早期食管癌、晚期食管癌都具有較好的靈敏度和特異度，不僅能夠用于晚期食管癌的診 斷，還能夠較好的用于食管鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷，對于改善食管鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后、降低死 亡率有很重要的意義。 本發(fā)明還提供了上述適合于食管鱗狀細(xì)胞癌早期診斷的診斷標(biāo)記物的篩選方法，通過 該方法所得的標(biāo)記物對于早期和晚期食管癌都具有很好的靈敏度和特異性，尤其是適合食 管癌的早期診斷，對于食管癌的治療有重要的臨床意義。 本發(fā)明還提供了一種食管鱗狀細(xì)胞癌診斷模型及診斷模型的構(gòu)建方法，該模型構(gòu)建方 法簡單，能夠代替現(xiàn)今有創(chuàng)的診斷方法，方便快捷，避免了待檢人員的痛苦，對于食管原位 癌、早期食管癌、晚期食管癌都具有較好的靈敏度和特異度，為食管鱗狀細(xì)胞癌的早診早治 提供了有效的技術(shù)支持。 本發(fā)明還提供了一種采用該診斷模型診斷食管鱗狀細(xì)胞癌的方法，采用本發(fā)明模型僅 通過取血就能進(jìn)行診斷，方便快捷，無內(nèi)創(chuàng)，尤其是對于早期食管癌靈敏度高，特異度好，具 有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0006] 目前，本領(lǐng)域大都從基因和大分子蛋白質(zhì)方面研究篩選食管鱗狀細(xì)胞癌診斷標(biāo)記 物，本發(fā)明一改以往的研究思路，首次提出采用血清代謝組學(xué)技術(shù)篩選食管鱗狀細(xì)胞癌診 斷標(biāo)記物的思路，發(fā)現(xiàn)了特別適合于食管鱗狀細(xì)胞癌早期診斷的標(biāo)記物，使不便于發(fā)現(xiàn)的 早期食管鱗狀細(xì)胞癌有了很好的診斷方法。本發(fā)明依托"國家食管癌早診早治示范基地 (山東省肥城市）"的食管癌篩檢與隨訪人群隊(duì)列，獲得食管原位癌（簡稱原位癌，0期39 例）、早期食管癌（簡稱早期癌，I期17例、II期11例）及晚期食管癌（簡稱晚期癌，III 期30例）患者的血清標(biāo)本，并隨機(jī)抽取經(jīng)確定無任何食管病變及其他代謝疾?。ㄈ缂卓?、 甲減、高血壓和糖尿病、腎病等）的健康人群為健康對照，使用UPLC-QT0F/MS獲得1466個(gè) 小分子代謝物的代謝指紋圖譜，經(jīng)過對食管癌患者、及健康對象的小分子代謝物的代謝指 紋圖譜的對比、分析，得到適合于食管鱗狀細(xì)胞癌早期診斷的診斷標(biāo)記物，以這些診斷標(biāo)記 物進(jìn)行模型構(gòu)建，得到食管癌診斷模型，利用該模型可以快速的診斷出是否為食管癌，尤其 是可以診斷出早期食管癌，靈敏度高、特異度好，具有臨床使用和推廣價(jià)值。 本發(fā)明中，所述食管原位癌是指?m分期標(biāo)準(zhǔn)中0期，指粘膜上皮層內(nèi)或皮膚表皮內(nèi) 的非典型增生（重度）累及上皮的全層，但尚未侵破基底膜而向下浸潤生長的癌；早期食 管癌是指?!分期標(biāo)準(zhǔn)中I和II期，指無淋巴結(jié)累及、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的局限于黏膜后或黏膜 下層的癌；晚期食管癌是指?m分期標(biāo)準(zhǔn)中III期和IV期，指已累及肌層或達(dá)外膜或外膜 以外，有局部或遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌。TOM分期標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)American joint Committee on Cancer(AJCC)TNM Classfication of Carcinoma of the Esophagus and Esophagogastric Junction(7th ed, 2010)〇
[0007] 本發(fā)明的診斷標(biāo)記物和診斷模型可以將無癥狀或癥狀不明顯的早期食管癌診斷 出來，無內(nèi)創(chuàng)性，減輕了檢測者的痛苦，且診斷過程簡潔、快速，提高了工作效率，對于食管 癌的早診早治、預(yù)后的改善、死亡率的降低都有十分重要的意義。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)方 案如下： 一種適合于食管鱗狀細(xì)胞癌早期診斷的診斷標(biāo)記物，為下述25種血清代謝標(biāo) 記物中的任意一種或一種以上的組合：beta-丙氨酸-賴氨酸（beta-Ala-Lys)，左 旋肌肽（L-Carnosine),順-9-十六碳稀酸（cis-9-Palmitoleic acid),棕櫚酸 (Palmitic acid),油酸（Oleic Acid),溶血磷脂酸 LPA(18:1(9Z)/0:0)，溶血卵磷脂 LysoPC (14:0/0:0)，溶血卵磷脂 LysoPC (18:2 (9Z, 12Z))，溶血卵磷脂 LysoPC (24:0)， 磷脂 PC(14:1(9Z)/P-18:1(11Z))，磷脂 PC(16:0/18:2(9Z, 12Z))，磷脂 PC(24:1(15Z) /22:6(4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z))，亞油酸（Linoleic acid)，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH)，皮質(zhì)醇（Cortisol) ,L-酪氨酸（L-Tyrosine) ,L-色氨酸（L-Tryptophan),甘氨 膽酸（Glycocholic Acid),牛橫膽酸鹽（Taurocholate),次黃噪呤（Hypoxanthine),尿 囊酸（Allanto ic acid),肌苷（Inosine), 1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine 1-phosphate)， 硫酸半乳糖基?；拾贝?-〇-Sulfogalactosylceramide (dl8:1/20:0)，乳糖神經(jīng)酰胺 Lactosylceramide(dl8:1/22:0)〇 上述診斷標(biāo)記物中，可以是上述25種血清代謝標(biāo)記物中的任意一種，也可以是它們之 間的兩種或者兩種以上的隨意組合。當(dāng)使用兩種或兩種以上的血清代謝標(biāo)記物的組合作為 診斷標(biāo)記物時(shí)，診斷的效果會優(yōu)于單一的血清代謝標(biāo)記物作為診斷標(biāo)記物的效果。
[0008] 進(jìn)一步的，上述診斷標(biāo)記物可以為下述（a)-(h)中的任意一種血清代謝標(biāo)記物的 組合：（a)可以為beta-丙氨酸-賴氨酸（beta-Ala-Lys)和左旋肌肽（L-Carnosine)的 組合；(b)或者為順-9-十六碳稀酸（cis-9-Palmitoleic acid)、棕櫚酸（Palmitic acid) 和油酸（Oleic Acid)的組合；（c)或者為溶血磷脂酸LPA(18:1 (9Z)/0:0)、溶血卵磷脂 LysoPC (14:0/0:0)、溶血卵磷脂 LysoPC (18:2 (9Z，12Z))和溶血卵磷脂 LysoPC (24:0)的組 合；（d)或者為磷脂 PC (14:1 (9Z) /P-18:1 (11Z))、磷脂 PC (16:0/18:2 (9Z，12Z))、磷脂 PC ( 24:1(15Z)/22:6(4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z))和亞油酸（Linoleic acid)的組合；（e)或者 為煙酰胺腺噪呤二核苷酸（NADH)、L-酪氨酸（L-Tyrosine)和L-色氨酸（L-Tryptophan) 的組合；(f)或者為皮質(zhì)醇（Cortisol)、甘氨膽酸（G1 ycocholic Acid)和?；悄懰猁} (Tauro