一種動(dòng)物組織中喹諾酮類藥物殘留的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種動(dòng)物組織中喹諾酮類藥物殘留的檢 測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 喹諾酮類（Quinolones，QNs)藥物是一類抗菌作用強(qiáng)、抗菌譜廣的人工合成抗菌 藥，廣泛應(yīng)用于臨床診斷、動(dòng)物疾病預(yù)防及促生長(zhǎng)。QNs在動(dòng)物源食品中的過量或不當(dāng)使 用會(huì)引起食用者產(chǎn)生潛在"三致"（致癌、致畸、致突變）作用，誘導(dǎo)致病菌產(chǎn)生耐藥性，從而 威脅人類健。因此，許多國(guó)家和組織都限制其使用并制訂出相應(yīng)的最高殘留限量(MRLs): 美國(guó)禁止在食用動(dòng)物養(yǎng)殖中使用FQNs ;日本批準(zhǔn)使用的QNs僅有恩諾沙星、二氟沙星、奧 比沙星、達(dá)氟沙星、馬波沙星、氧氟沙星和惡喹酸。歐盟規(guī)定動(dòng)物肌肉、肝臟和腎臟中達(dá)氟 沙星、二氟沙星、恩諾沙星(環(huán)丙沙星與恩諾沙星量之和)、保沙星、沙拉沙星等的MRLs為 0.0 lmg-L 9mg，并在NO. 508/1999號(hào)法規(guī)中對(duì)牛奶中單諾沙星、氟甲喹、馬波沙星、恩諾沙 星和環(huán)丙沙星的最高殘留限量作了規(guī)定；世界食品法典委員會(huì)和世界各國(guó)對(duì)水產(chǎn)品中QNs 殘留均有嚴(yán)格的限量要求，國(guó)際貿(mào)易中也對(duì)其限量有嚴(yán)格規(guī)定；我國(guó)于2002年規(guī)定了環(huán)丙 沙星、單諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、惡喹酸和氟甲喹等7種QNs藥物在動(dòng)物肌 肉組織中的最尚殘留限量為10~500 μ g/kg。因此，對(duì)動(dòng)物源食品中QNs殘留量的檢測(cè)尤 為重要。
[0003] 目前QNs的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法（HPLC)、高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法 (HPLC-MS/MS)、酶聯(lián)免疫法（ELISA)等。其中HPLC-MS/MS法靈敏度高、檢測(cè)限低、測(cè)定種類 多、集高效分離和結(jié)構(gòu)鑒定于一體，該儀器在我國(guó)檢測(cè)機(jī)構(gòu)中的配置也較為普遍，已成為復(fù) 雜混合物中痕量組分定性和定量的有力工具，已經(jīng)制定了相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。檢測(cè)包括樣品前 處理和儀器分析兩部分，而樣品前處理技術(shù)嚴(yán)重落后于上機(jī)檢測(cè)技術(shù)。樣品前處理常用的 有液液萃?。↙LE)和固相萃取（SPE) ;LLE是凈化QNs的基本方法，但存在操作費(fèi)時(shí)、消耗高 純?nèi)軇┒嘁约皹悠芬兹榛龋籗PE消耗溶劑少、不產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，是凈化QNs最常用的方法， 但目前市場(chǎng)上商品化的固相萃取柱一般只能一次性使用，價(jià)格較高，從而導(dǎo)致了高成本。另 外還有基質(zhì)固相分散萃取、超臨界流體萃取、固相微萃取、加速溶劑萃取和分子印跡固相萃 取等較新的方法也應(yīng)用至QNs殘留分析，但都處于研究階段，技術(shù)尚不成熟。
[0004] 本申請(qǐng)的發(fā)明人致力于動(dòng)物源食品中喹諾酮類殘留檢測(cè)的研究，發(fā)明專利申請(qǐng) CN104316615A (膜透析-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源食品中7種喹諾酮?dú)埩舻姆?法）中采用膜透析處理樣品，在5.0、10. 0、25.0 μ g/kg 3個(gè)濃度添加水平平均回收率在 65. 5%~84. 1%之間，變異系數(shù)在4. 3%~11. 6%之間，樣品處理簡(jiǎn)單、靈敏度高，重現(xiàn)性好， 經(jīng)濟(jì)，可用于動(dòng)物源食品中7喹諾酮類殘留的檢測(cè)確證。但是采用膜透析法處理樣品耗時(shí) 長(zhǎng)(透析時(shí)間彡6h)，不利于樣品的快速檢測(cè)。超濾（ultrafiltration，UF)主要為篩分機(jī) 理，通常為不對(duì)稱結(jié)構(gòu)，膜孔徑的大小和膜表面的性質(zhì)起著不同的截留作用。其過濾粒徑介 于微濾和反滲透之間，約2~100nm，操作壓力在0. 1~0. 5Mpa。其出現(xiàn)為動(dòng)物性食品中農(nóng)獸藥 殘留檢測(cè)的前處理方法的改進(jìn)提供了新的契機(jī)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種動(dòng)物組織中喹諾酮類藥物殘留的檢測(cè)方法，采用超濾 法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，儀器分析采用HPLC-MS/MS，可同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物源性食品中恩諾沙星 (ENR)、環(huán)丙沙星（CIP)、惡喹酸（0X0)、沙拉沙星（SAR)、雙氟沙星（DIF)、氟甲喹（FLU)、萘啶 酸（NDL)、氧氟沙星（0FL)、諾氟沙星（N0R)、丹諾沙星（DAN) 10種喹諾酮類藥物。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種動(dòng)物組織中喹諾酮類藥物殘留的檢測(cè)方法，其包括步 驟：將待測(cè)組織樣品經(jīng)預(yù)處理后，提取上清液加入超濾管中，超濾管放入離心機(jī)中離心，離 心出的液體取出用氮?dú)獯蹈?，流?dòng)相定容，供儀器測(cè)定分析。
[0007] 其中，所述預(yù)處理步驟為：準(zhǔn)確稱取5. 00 g粉碎好的樣品，加入20 mLl%乙酸酸化 乙腈，混勾，超聲20 min，加烘好后的無水硫酸鈉5 g混勾，8000 r/min的速率離心5 min; 所述超濾管為50 mL，截留分子量為3kD ; 所述離心為低溫離心，優(yōu)選5000 r/min離心10min。
[0008] 本發(fā)明儀器測(cè)定分析采用HPLC-MS/MS，其液相色譜柱采用通用性，填料選自十八 烷基鍵合相硅膠，流動(dòng)相為〇. 1%甲酸溶液A-乙腈B，通過調(diào)整流動(dòng)相比例和梯度均能達(dá)到 滿意的峰形和分離效果。采用Waters Xbridge C18, 3.5 μπι 2. 1X150 mm色譜柱時(shí)，流動(dòng) 相：0. 1% 甲酸溶液 A-乙腈 B，流速：0. 2 mL /min，梯度洗脫：t= 0 min，80%A，20% B; t= I min,80%A, 20%B ； t=6min, 40%A, 60% B ；t=10 min, 20%A, 80% B ；t=14 min, 20%A, 80% B ; t=14. I min，80%A, 20% B ; t=20min, 80%A, 20% B ;質(zhì)譜條件為：電噴霧電離源正離子掃 描（ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM);電噴霧電壓：5.0 kV;離子源溫度：500 °C，霧化氣壓 力（GSl): 70 psi ;輔助氣流速（GS2): 55 psi，氣簾氣壓力（CUR): 20psi ;碰撞室入口電 壓（EP) : 10 V ;碰撞室出口電壓（CXP): 10 V，監(jiān)測(cè)分析物的離子對(duì)進(jìn)行藥物殘留確證分 析。
[0009] 本發(fā)明采用50 mL，截留分子量3kD的超濾管，10種分子量在200-400間的喹諾酮 經(jīng)1%乙酸酸化乙腈提取，在離心力作用下均可從超濾管中被快速"過濾"出來，而被截留的 大分子物質(zhì)在離心時(shí)不會(huì)損壞超濾膜。該前處理方法可同時(shí)提取10種喹諾酮，應(yīng)用本發(fā)明 的HPLC-MS/MS測(cè)定，平均回收率在71. 4%~85. 9%之間，變異系數(shù)在3. 9%~10. 7%之間， 具有較好的回收率、穩(wěn)定性和重復(fù)性。另外，大分子雜質(zhì)被截留，因此大大降低了基質(zhì)效應(yīng)。 該方法完全可以滿足動(dòng)物源性食品中10種喹諾酮的日常檢測(cè)要求。
【附圖說明】
[0010] 圖1-圖10為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)的特征離子色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 1.樣品的前處理 準(zhǔn)確稱取5.00 g粉碎好的樣品，加入20 mLl%乙酸酸化乙腈，混勻，超聲20 min，加烘 好后的無水硫酸鈉5 g混勾，8000 r/