一種用于肺癌診斷的sall4免疫組織化學(xué)檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于肺癌診斷的SALL4免疫組織化學(xué)檢測試劑盒、使用方法及應(yīng) 用，屬于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是當(dāng)今全球最常見的惡性腫瘤之一，危害嚴(yán)重并呈上升趨勢(shì)，是全球發(fā)病率 和死亡率增加最快的疾病。肺癌的高病死率主要是由于無法做到早期診斷，因此，肺癌的早 期診斷是及時(shí)規(guī)范治療并改善其預(yù)后的最有效措施。目前傳統(tǒng)的診斷方法依賴于影像學(xué)和 纖維支氣管鏡檢查，但是這兩種方法具有操作復(fù)雜、有輻射副作用及費(fèi)用高等局限。腫瘤標(biāo) 志物的發(fā)現(xiàn)和合理應(yīng)用對(duì)腫瘤早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷具有重要意義。
[0003] 腫瘤標(biāo)志物是腫瘤細(xì)胞在癌變過程中由于基因的表達(dá)水平的變化而生成或減少 的抗原和其它生物活性物質(zhì)，可用于腫瘤的早期診斷、分期、監(jiān)測腫瘤進(jìn)程和評(píng)價(jià)藥物的治 療效果。腫瘤標(biāo)志物會(huì)對(duì)腫瘤的臨床治療帶來巨大的影響，尤其當(dāng)其能夠在臨床病癥出現(xiàn) 之前被檢測到，或者可以用于治療效果的實(shí)時(shí)檢測時(shí)。與傳統(tǒng)的診斷手段相比，腫瘤標(biāo)志物 檢測具有簡便、費(fèi)用相對(duì)低、沒有輻射危害、風(fēng)險(xiǎn)小、病人容易接受等優(yōu)點(diǎn)。目前，為了滿足 腫瘤的臨床診斷和治療的需求，腫瘤標(biāo)志物的研發(fā)亟待加速。
[0004] 目前用于腫瘤早期診斷的腫瘤標(biāo)志物，大多由于缺乏靈敏度和特異性而不能在實(shí) 際檢測中廣泛應(yīng)用。例如，對(duì)于肝癌，甲胎蛋白和超聲波檢查是普遍采用的診斷高危病人的 方式，并且確實(shí)顯著提高了肝癌病人的生存率，但靈敏度比較低；腫瘤抗原CA-125有更高 的靈敏度，但卻缺乏特異性。同樣地，用于乳腺癌檢測的血液腫瘤標(biāo)志物CA15-3因靈敏度 低，在早期診斷中幾乎沒用。腫瘤的早期診斷、以及良性和惡性腫瘤的區(qū)分仍然是一個(gè)臨床 難題，需要新的技術(shù)和方法來發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)志物和提高腫瘤標(biāo)志物檢測的靈敏度和可信 度。而針對(duì)高發(fā)病率和死亡率的肺癌，尋找高敏感性和特異性的標(biāo)志物，對(duì)肺癌的診斷和治 療具有重大意義，已成為肺癌防治的當(dāng)務(wù)之急。
[0005] SALL4蛋白由人源基因 SALL4編碼翻譯，其全稱為Sal樣蛋白4(Sal-like protein 4)，別名鋅指蛋白 797 (Zinc finger protein 797)和鋅指蛋白 SALL4 (Zinc finger protein SALL4)。SALL4屬于Sal C2H2類鋅指蛋白家族，包含有C2H2類鋅指結(jié)構(gòu)。SALL4 蛋白有兩個(gè)亞型，即SALL4A和SALL4B，其分子量大小分別為112. 2KD和65. 7KD。SALL4蛋 白主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。
[0006] SALL4屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子，通過與0CT3/4、S0X2及NANOG相互作用，參與干細(xì)胞的 自我更新和維持。SALL4不但在胚胎干細(xì)胞中高表達(dá)，而且在人造血系統(tǒng)腫瘤中也高表達(dá)， 例如急性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞白血病。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SALL4能夠上調(diào)原癌基因 Bmi-I在人造血 干細(xì)胞和白血病細(xì)胞中的表達(dá)。其它一些研究表明，SALL4可以作為腫瘤標(biāo)記物，在肺癌和 乳腺癌的診斷中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。SALL4 mRNA在肺癌敏感性和特異性分別為85. 1% 和92.9%，93%的肺癌標(biāo)本541^4 1111^^是癌旁的兩倍。關(guān)于541^4蛋白在肺癌細(xì)胞中的表 達(dá)，以及作為一種肺癌標(biāo)志物進(jìn)行肺癌診斷的可行性，目前尚無相關(guān)報(bào)道。
[0007] 目前，在臨床上，免疫組織化學(xué)染色已經(jīng)在腫瘤病理診斷中得到了廣泛應(yīng)用，涉 及領(lǐng)域包括腫瘤組織起源的鑒別、未分化惡性腫瘤性質(zhì)的判定、各種形態(tài)系統(tǒng)腫瘤鑒別、確 定腫瘤原發(fā)部位等。其原理是用標(biāo)記的抗體對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)的抗原進(jìn)行定性、定位 或定量檢測，經(jīng)過組織化學(xué)的呈色反應(yīng)而呈現(xiàn)醒目的陽性色彩，再用光學(xué)顯微鏡、熒光顯微 鏡或電子顯微鏡觀察。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的之一，是提供一種用于肺癌診斷的SALL4免疫組織化學(xué)檢測試劑盒 及其使用方法，可有效地區(qū)分肺癌組織和正常組織，還可為肺癌個(gè)體化治療提供新的診斷 和分類依據(jù)。
[0009] 本發(fā)明的目的之二，是提供一種用于肺癌診斷的SALL4免疫組織化學(xué)檢測試劑盒 的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種用于肺癌診斷的SALL4免疫組織 化學(xué)檢測試劑盒，包括如下組分：陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、一抗、二抗、固定劑、脫脂和透明劑、 復(fù)水劑、脫水劑、緩沖液A、緩沖液B、抗原修復(fù)劑、通透劑、過氧化物酶失活劑、非特異性蛋 白阻斷劑、顯色液和染色劑。
[0011] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。
[0012] 進(jìn)一步，所述陽性對(duì)照為SALL4高表達(dá)的精原細(xì)胞瘤組織，所述陰性對(duì)照為：不含 SALL4抗體的羊血清孵育的肺鱗癌組織。
[0013] 進(jìn)一步，所述一抗為小鼠來源的抗人SALL4單克隆抗體，所述二抗為生物素標(biāo)記 的山羊抗小鼠 IgG，所述固定劑為福爾馬林，所述脫脂和透明劑為二甲苯，所述復(fù)水劑為濃 度為100 % v/v、90 % v/v、80 % v/v、70 % v/v的梯度酒精，所述脫水劑為濃度為70 % v/ v、80% v/v、90% v/v、100% v/v的梯度酒精，所述緩沖液A為ImM PBS(PH7. 4)，所述緩沖 液B為ImM PBST(PH7. 4)，所述抗原修復(fù)劑為ImM Tris/EDTA(PH8)，所述通透劑為0. 3% Triton-100,所述過氧化物酶失活劑為3 % v/v的過氧化氫，所述非特異性蛋白阻斷劑為 〇. 5%羊血清，所述顯色液為DAB，所述染色劑為蘇木精。
[0014] 一種用于肺癌診斷的SALL4免疫組織化學(xué)檢測試劑盒的使用方法，包括如下步 驟：
[0015] (1)取待測樣品和陽性對(duì)照分別進(jìn)行福爾馬林固定，4°C放置12小時(shí)；
[0016] (2)將步驟所得⑴固定標(biāo)本，進(jìn)行石蠟包埋，制成4 μπι厚石蠟切片，置于37°C干 燥12小時(shí)，得到干燥后的切片；
[0017] (3)脫蠟復(fù)水：將步驟⑵所得干燥后的切片，于60°C烘烤2小時(shí)，再用脫脂和透 明劑脫蠟5分鐘，然后用復(fù)水劑復(fù)水，每梯度2分鐘，再用無菌水沖洗2分鐘，得到復(fù)水切 片；
[0018] (4)將步驟（3)所得復(fù)水切片，加入通透劑，對(duì)組織進(jìn)行通透，室溫放置3分鐘，移 去通透劑，再用洗滌劑沖洗5分鐘，得到通透切片；
[0019] (5)將步驟（4)所得通透切片，用過氧化物酶失活劑浸泡10分鐘，進(jìn)行內(nèi)源性過氧 化物酶活性封閉，再用緩沖液A沖洗5分鐘，得到內(nèi)源性過氧化酶失活切片；
[0020] (6)將步驟（5)所得內(nèi)源性過氧化物酶失活切片，置于抗原修復(fù)劑中，沸水煮3分 鐘，進(jìn)行抗原修復(fù)，室溫冷卻，用緩沖液A沖洗5分鐘，得到抗原修復(fù)切片；
[0021] (7)將步驟（6)所得抗原修復(fù)切片，加非特異性蛋白阻斷劑，常溫封閉1小時(shí)，得到 非特異性抗體封閉切片；
[0022] (8)將步驟（7)所得非特異性抗體封閉切片，除陰性對(duì)照只加非特異性蛋白阻斷 劑，其余切片均加非特異性蛋白阻斷劑稀釋的10 μ g/ml的一抗，然后室溫孵育2小時(shí)，依次 用緩沖液A和緩沖液B沖洗，各沖洗3次，每次5分鐘，得到一抗后的切片；
[0023] (9)將步驟（8)所得一抗后的切片，加入200倍非特異性蛋白阻斷劑稀釋的二抗， 室溫孵育1小時(shí)，依次用緩沖液A和緩沖液B沖洗，各沖洗3次，每次5分鐘，得到二抗后的 切片；
[0024] (10)將步驟（9)所得二抗后切片，用新鮮配制的顯色液染色，室溫孵育5分鐘，得 到染色后的切片；
[0025] (11)將步驟（10)所得染色后的切片，自來水沖洗3分鐘，染色劑復(fù)染3分鐘，自 來水沖洗3分鐘，得到復(fù)染切片；
[0026] (12)將步驟（11)所得復(fù)染切片，用脫水劑脫水干燥，每梯度2分鐘，再用脫脂和透 明劑透明5分鐘，中性樹膠封固，即得SALL4免疫組織化學(xué)染色切片；
[0027] (13)將步驟（12)所得SALL4免疫組織化學(xué)染色切片，置于光學(xué)顯微鏡下，觀察染 色程度、統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)目，再結(jié)合陽性對(duì)照和陰性對(duì)照的結(jié)果，判斷待測樣品是否為肺癌 組織。
[0028] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。
[0029] 進(jìn)一步，步驟（1)所述待測樣品，為從病