牛布魯氏菌間接elisa抗體檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種動物布魯氏菌病的診斷方法--牛布魯氏菌間接ELISA抗體檢測 試劑盒，屬生物制品檢測技術領域。 技術背景
[0002] 布魯氏菌病（布?。┦怯刹剪斒暇蚍Q布魯氏菌（Brucella)引起的以流產和發(fā) 熱為特征的人獸共患病，嚴重地威脅著人和多種動物的生命健康。本病不但對動物的繁殖 和生產性能具有嚴重危害，更重要的是，人感染布魯氏菌后，往往難以治愈，從而造成嚴重 的公共衛(wèi)生問題。因此在布魯氏菌流行的國家，消除布病一直是公共衛(wèi)生計劃中最重要的 目標之一。
[0003] 布病在世界存在已有久遠的歷史，人類對該病的研究認識逐步加深，診斷水平不 斷提高，隨著動物布病的研究進展，動物布病血清學的檢測方法不斷改進和提高。傳統(tǒng)的凝 集試驗（如：虎紅抗原平板凝集試驗、試管抗原凝集試驗、乳環(huán)凝集試驗）逐漸被敏感性高、 特異性強的ELISA方法、熒光偏振試驗（FPA)等新的檢測技術所取代。
[0004] 凝集試驗是布魯氏菌病診斷的一種常用的方法，包括血清凝集實驗、乳環(huán)沉淀試 驗和抗人免疫球蛋白試驗，其中經典的標準試管凝集試驗（STAT)、平板凝集試驗（PAT)，以 上方法在發(fā)達國家已經基本停止使用，取而代之的是緩沖布魯氏菌抗原凝集試驗如虎紅平 板凝集試驗（RBPT)?；⒓t平板凝集抗原是用抗原性良好的布魯氏菌菌株經培養(yǎng)，滅活，離心 收集菌體后用虎紅染料染色后懸浮于乳酸緩沖液中制成，該方法靈敏度高，價格便宜，操作 方便，檢測快速，適于動物群體布魯氏菌病的普查。在國際貿易中是牛、羊、豬布魯氏菌病檢 測的指定試驗，在我國也用于人布魯氏菌病監(jiān)測的初篩。乳環(huán)沉淀試驗依然是乳牛布魯氏 菌監(jiān)測的主要方法，該方法直接對牛乳進行檢測，可以對奶牛群體進行篩檢，該方法簡便快 速。凝集試驗主要檢測抗布魯氏菌LPS- 0鏈的抗體，而布魯氏菌的LPS- 0鏈是多種革 蘭氏陰性菌的共同抗原，因此布魯氏菌與其他革蘭氏陰性菌存在的交叉感染用試管凝集試 驗無法鑒別，這也是布魯氏菌病診斷存在的一大難題。
[0005] 在布魯氏菌病血清學檢驗中一致認為補體結合試驗（CFT)在特異性上優(yōu)于其他 方法，常被用來對試管凝集試驗和虎紅平板凝集試驗檢測為陽性或可疑的病例進行定性檢 測。補體結合試驗一直被認為是最有效的布病診斷方法，至今尚沒有一種診斷方法能取代 補體結合試驗在血清學診斷中的地位。但補體結合試驗所需要的溶血素的制備困難，試驗 操作繁瑣，難以在臨床上普遍使用，而且由于豬體內的補體會干擾豚鼠補體的作用，導致敏 感性下降。
[0006] ELISA是一種與CFT效果相當的診斷方法，該方法操作方便，靈敏度高，特異性較 好，一次可以完成大量樣品的檢測，既可以作為篩選試驗應用于動物群體檢疫，還可以作為 確診試驗。ELISA不僅可以應用于血清抗體的檢測，還可應用于乳樣中抗體的檢測。牛布魯 氏菌病ELISA檢測方法已是國際貿易中指定的檢測方法之一，該方法解決了常規(guī)方法耗時 費力的不足，提高了檢測的特異性、敏感性和便捷性。用于布魯氏菌病檢測的ELISA有間接 ELISA(iELISA)和競爭ELISA(cELISA)兩種。目前研究報道的或已經商業(yè)化生產的布魯氏 菌iELISA和cELISA試劑盒存在的主要技術缺陷在于不能有效排除耶爾森氏菌09和大腸 桿菌0157感染動物的血清干擾，從而使其特異性受到一定程度影響。申請人曾經篩選獲得 了一株只與布魯氏菌反應，不與耶爾森氏菌09和大腸桿菌0157反應的特異性單克隆抗體， 并在此基礎上開發(fā)了動物布魯氏菌cELISA試劑盒，該技術不僅已經獲得了專利證書（專利 號：ZL201310213811. 5)，而且已經完成了中試、臨床試驗，并通過了新獸藥評審初審，正在 進行制品的質量復核檢驗。本發(fā)明主要是通過篩選特定布魯氏菌，提取其脂多糖（LPS作為 包被抗原，并對包被抗原提純工藝以及試劑盒組分進行優(yōu)化，成功開發(fā)了高特異性和敏感 性的牛布魯氏菌間接ELISA抗體檢測試劑盒，豐富了我國布病診斷技術。
[0007] 2013年，山東奶牛中心公布了一種"牛布魯氏菌間接ELISA檢測試劑盒"的發(fā)明 專利，在該試劑盒中，使用了大腸桿菌表達的布魯氏菌特異性VirbS蛋白作為包被抗原進 行布病檢測。雖然Virb8蛋白為布魯氏菌所特異，但是在人工感染模型中，只有特定動物在 感染特定種屬布魯氏菌后才能產生針對VirbS的抗體。也就是說VirbS抗體產生具有感染 宿主和布魯氏菌種屬的特異性，能夠檢測到VirbS蛋白抗體的牛很可能感染了布魯氏菌， 但更多情況是感染了布魯氏菌但未產生針對VirbS蛋白的抗體，從而使該試劑盒存在較高 比例漏檢。LPS是布魯氏菌最主要的特異性抗原，在感染動物體內產生強烈的抗體反應，相 對于布魯氏菌各種外膜蛋白或功能蛋白，LPS抗體占有幾乎絕對的優(yōu)勢，通過檢測布魯氏菌 LPS抗體是布魯氏菌檢測的可靠方法，也是國際通行做法。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于建立一種牛布魯氏菌診斷的高通量抗體檢測技術，其核心是采 用豬種布魯氏菌S2株LPS代替國外同類診斷技術中采用的A99株LPS，提高了檢測的敏感 性；通過改進LPS純化和純度測定方法，能有效排除小腸結腸炎耶爾森氏菌09和大腸桿菌 0157對布魯氏菌病檢測的干擾，以及具有良好特異性和敏感性的牛布魯氏菌高通量的檢測 試劑盒。
[0009] 本發(fā)明的技術路線是選取我國獨有的布魯氏菌S2株，以此菌株提取的LPS具有良 好的敏感性，本研究同時發(fā)現以布魯氏菌S2株提取LPS其產量高于以A99和S1119株的產 量，能有效降低生產成本；本發(fā)明在常規(guī)提取LPS方法的基礎上，增加了蛋白酶K消化和苯 酚抽提步驟，有效提高了LPS純度；采用標準曲線和0D529nm吸光度值相結合的方法，建立 了LPS純度檢測方法；通過上述技術改進，使本發(fā)明建立的ELISA方法能一般革蘭氏陰性細 菌以及耶爾森氏菌09和大腸桿菌0157對布魯氏菌病檢測的干擾；另外，經配方優(yōu)化處理， 使試劑盒背景控制良好，并縮短了檢測時間，提高了檢測效率。
[0010] 本發(fā)明利用布魯氏菌S2株LPS作為包被抗原，以人工免疫健康牛制備陽性血清， 以采集健康非免疫牛血清作陰性血清，以HRP標記兔抗牛IgG、底物溶液、終止液、樣品稀釋 液、HRP標記兔抗牛IgG稀釋液及20X洗滌液等組分組裝而成。
[0011] 本發(fā)明技術方案
[0012] 1. -種牛布魯氏菌間接ELISA抗體檢測試劑盒，該試劑盒主要含有：以制備的光 滑型豬種布魯氏菌S2株的脂多糖（LPS)作為包被抗原，以人工免疫健康牛制備陽性血清， 以采集健康非免疫牛血清作陰性血清，以HRP標記兔抗牛IgG、底物溶液、終止液、樣品稀釋 液、HRP標記兔抗牛IgG稀釋液及20X洗滌液等組分組裝而成，用于檢測牛血清中的光滑 型布魯氏菌抗體。其中：
[0013] (1)該試劑盒中使用的包被抗原LPS來源于豬種布魯氏菌（S2株），該LPS對豬、 牛、羊布魯氏菌病的病原菌具有良好的敏感性，提高了試劑盒檢測的敏感性；
[0014] (2)LPS提取過程中增加了蛋白酶K消化和苯酚抽提步驟，提高了LPS純度，減少 了LPS中陰雜蛋白含量過高導致的非特異性反應；本試劑盒不僅能有效排除常規(guī)革蘭氏陰 性細菌對布魯氏菌的干擾，而且能排除一般布病間接ELISA試劑盒無法區(qū)分小腸結腸炎耶 爾森氏菌09和大腸桿菌0157干擾的技術缺陷，提高了檢測的特異性；
[0015] (3)LPS的包被量基于對其純度和質量的測定；
[0016] (4)本發(fā)明通過對主要試劑配方的改進和優(yōu)化，有效控制試劑盒的反應背景，縮短 了檢測所需的時間。
[0017] 2.該試劑盒中LPS抗原的純度測定方法是：
[0018] 將商品化LPS標準品稀釋成lmg/ml、100yg/ml、10yg/ml、Iyg/ml、100ng/ml、 lOng/ml等不同稀釋度；同時根據稱重結果將LPS配制成lmg/ml的初始濃度，并稀釋成 100yg/ml的濃度。將上述各稀釋度的LPS溶液取100y1/樣品加入96孔酶標板上，在 529nm波長下讀取吸光度。建立LPS標準品各稀釋度的0D529值，并建立濃度與吸光度之間 的標準曲線。根據標準曲線以及布魯氏菌LPS吸光度，計算LPS的濃度。LPS純度為：LPS 濃度X單位體積/單位質量。
[0019] 3.使用該試劑盒能對牛布魯氏菌病進行高通量檢測。
[0020] 本發(fā)明【具體實施方式】
[0021] 1.本申請建立了抗原制備用菌種（豬種布魯氏菌S2株，B.suisS2)的質量標準。
[0022] (1)菌落形態(tài)菌落邊緣整齊、圓潤，露滴狀，斜光照射，逆光觀察微帶藍色乳光。
[0023] (2)染色形態(tài)為球桿菌，單個散在，不形成芽孢和莢膜。大小在0. 3~0. 6ym之 間。革蘭氏染色為陰性，柯氏染色為紅色。
[0024] (3)純粹檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行，應純粹。
[0025] (4)特異性檢驗
[0026] 1)血清學特異性以培養(yǎng)物制成抗原，與光滑型布魯氏菌陽性血清應出現凝集，與 粗糙型血清不出現凝集。
[0027] 2)PCR特異性合成如下4條引物，將其配成引物混合儲存液，各引物濃度均為 25yM0
[0028] Feri:5' -GCGCCGCGAAGAACTTATCAA-3'（序列 1)
[0029] Reri:5'-CGCCATGTTAGCGGCGGTGA-3'（序列 2)