視野(430 μmX330 μπι)內(nèi)左右方向約每3 μm就有厚度差異，因此將視野中心的液厚度設為液厚度h。此次，將含有直徑300nm、16pM的順磁性磁微粒303的溶液304注入2片玻璃的間隙，通過散射光觀察了將磁微粒303用磁場305吸引到下方的載玻片301側時的h = 40、60、80、100、120、140 4111處的粒子的形狀。以各液厚度時的亮點數(shù)、以及亮點尺寸形式，由圖像獲得平均亮點像素數(shù)。
[0034]圖4中，將由圖像獲得的實測亮點數(shù)除以由所提供的磁微粒303數(shù)求得的理論亮點數(shù)后相對于液厚度作圖。進而，圖5中示出對平均亮點像素數(shù)和液厚度作圖而得的圖表。結果確認了，在h = 40?80 μm情況下磁微粒303的亮點數(shù)不變，但當超過h = 100 μπι時，隨著液厚度h增大，粒子的實測亮點數(shù)/理論亮點數(shù)之比降至0.8以下。另一方面確認了，磁微粒303直徑(平均亮點像素數(shù))隨著亮點數(shù)的減少而增大。這表示隨著液厚度增大，磁微粒303的聚集加劇。進而確認了，固定的形態(tài)也不同，如圖6所示，h = 40 μπι時，粒子微細、密集地進行固定，與此相對地，圖7中，h = 140 μπι時形成了大粒子，稀疏地進行固定。進而，此時還確認了粒子的頂點的焦點模糊、沿著ζ軸方向形成2?3 μπι左右的聚集體。確認了在h = 100 μπι以下時看不到這樣的焦點偏移，可以將磁微粒303固定為密集且薄的層。
[0035]實施例2
[0036]使用圖8來說明利用基于實施例1的結果將液厚度調(diào)整為100 μπι以下的器件進行生物分子計測的步驟的一個例子。器件中，固定磁微粒的支撐基板801使用了26mmX 76臟、厚度為1.2mm的載玻片(松浪硝子工業(yè))。作為覆蓋材802，使用了 8mmX8mm、厚度為0.15mm的蓋玻片(松浪硝子工業(yè))。二者用氫氟酸緩沖液(HF:NH4F = 1:200)洗滌I分鐘或用IN KOH洗滌60分鐘，用蒸餾水確認接觸角為10°以下。然后，將厚度0.05mm的聚酰亞胺帶(中興化成)切成寬度Imm后按照形成與覆蓋材802同尺寸的正方形的框的方式將其貼合在支撐基板801上，在其上配置覆蓋材802。由此制作用玻璃夾持了上下的7mmX7mm、高度為50 μπι的室。此時，室并非完全密閉，可以預先設置溶液的入口和空氣的出口。由此，僅通過將溶液滴加到入口附近，如圖8-(a)、(b)所示，通過毛細管現(xiàn)象含有磁微粒的溶液803被逐漸吸入室內(nèi)并均一地擴展。因此不必施加高壓來送液，也不必嚴格地將室密閉。但是，為了使溶液803不會由入口附近泄露至室外，理想的是在入口部分插入有機硅管、硅化接頭等表面具有疏水性的送液管804來添加溶液803的方法。同樣，出口側也可以配置具有疏水性的排出管805以僅排出空氣。此次使用了外徑為1.0mm、內(nèi)徑為0.5mm的有機娃管。溶液量根據(jù)室的體積而調(diào)整。例如，此次為了使溶液充滿室整面而調(diào)整為3 μ I左右的溶液量。例如，以正方格將300nm的磁微粒在支撐基板801上呈正方格狀地鋪滿一層時，為1.1 X 107個/mm2的密度。因此，通過將3ul的300pM的磁微粒溶液803導入前述室中，可以提供一層程度的磁微粒。此外，導入溶液803時，需要預先將對器件施加的磁場806關閉，直至磁微粒均一分散至室內(nèi)為止。磁場806可以利用永磁石、電磁石中任一者，更廉價且簡便的方法是使永磁石吸附和脫離的方法。使用電磁石時，磁場806的開放/關閉的切換雖便利但結構較大。此次，使用了永磁石進行磁微粒的固定。永磁石利用了具有0.5特斯拉(T)的磁束密度的Φ 20mmX 1mm的釹磁石。在室的正下方配置可將釹磁石固定的架子，從而可手動地放入取出磁石而進行磁場806的開放/關閉的切換。
[0037]以下使用圖9說明試樣的調(diào)制方法。在欲檢測的生物分子為抗原901時，事先用帶抗體902的磁微粒903進行捕捉，進而，用帶有抗體902的熒光色素904進行標記。這些反應全部在常溫下、反應用緩沖液(tris緩沖液(pH8.0)、50mM NaCl,0.1% Tween20)中進行。帶有抗體902的磁微粒903和抗原901的反應以及熒光標記抗體902和抗原901的反應何者在先均可，也可以同時進行?？乖?01可以使用所有種類的抗體，抗體902選擇對抗原901特異性高的抗體為佳。例如，此次，選擇前列腺癌的腫瘤標志物PSA(前列腺特異抗原)作為抗原901。PSA抗體需要為結合至磁微粒側的和熒光色素標記的兩者。抗體902可以是多克隆抗體也可以是單克隆抗體，在為多克隆抗體時可以使用同種抗體?？贵w902可根據(jù)抗原901的種類而選擇合適的抗體。理想的方法是，磁微粒側選擇單克隆抗體、熒光色素側選擇多克隆抗體，先使帶有單克隆抗體的磁微粒903和抗原901反應，然后使多克隆抗體反應。這是由于，若先使多克隆抗體反應，則有抗原上的結合位點被封閉的可能性。在使抗體902與磁微粒結合時，準備能夠以保持抗體902的活性的狀態(tài)進行結合的帶有第二抗體905的磁微粒。這些磁微粒903市場上有售，可以容易獲得。例如，作為順磁性微粒903，可以利用Ademtech公司的抗小鼠IgG修飾Adembeads ( Φ 300nm)。相對于第二抗體905修飾磁微?；旌霞s10倍以上的PSA抗體并孵育。然后用磁場907捕捉磁微粒903后除去溶液，用干凈的緩沖液懸浮。重復該操作直至能夠除去大部分未反應的抗體。作為磁微粒903，還可以使用鏈霉親和素修飾的磁微粒。例如，可以利用Ademtech公司的鏈霉親和素修飾Adembeads ( Φ lOOnm、Φ 200nm、Φ 300nm)。此時，使用生物素化抗體902，使抗體902結合在磁微粒903表面。
[0038]關于熒光色素，市場銷售有各種種類。例如FITC、Alexa (注冊商標)、CY5等被廣為所知。但是，本研究中為了能夠檢測至少一分子的抗原901，理想的是利用亮度高、消光時間長的熒光色素。作為這樣的熒光色素，可以使用例如數(shù)百分子的熒光色素結合在一個枝狀的碳鏈上的樹枝狀聚合物型熒光色素、熒光聚苯乙烯珠、量子點。
[0039]本實施例中，對使用熒光聚苯乙烯珠作為熒光色素904的抗體902的熒光標記方法進行說明。焚光聚苯乙稀珠可以利用由例如Invitrogen公司銷售的FluoSphereF8771 (注冊商標)。該珠外周包覆有鏈霉親和素，可以與生物素化抗體902結合。用帶有抗體902的熒光聚苯乙烯珠和帶有抗體902的磁微粒夾著抗原901而進行捕捉。反應步驟是:首先在反應容器內(nèi)加入抗體902和磁微粒，充分攪拌。用磁場907收集磁微粒903，將包含未反應的抗體902的上清除去，并用反應緩沖液懸浮。然后，在該溶液中裝入加入了欲檢測的抗原901的溶液后，充分混合并孵育I小時。此時，使反應容器上下旋轉或振蕩而進行攪拌，由此可加快抗原901和抗體902的反應?；旌系谋嚷适鞘箮Э贵w902的磁微粒903比抗原901過量，以此方式進行混合。具體而言，相對于設定的抗原901量加入100?10000倍量的帶抗體902的磁微粒903。然后，在該反應液中加入帶有熒光色素904的抗體902，再孵育數(shù)分鐘。帶有熒光色素904的抗體902也同樣地相對于抗原901量為100?10000倍量，即過量，根據(jù)情況可以加入更多。通過分別加入過剩的量，與抗原901的碰撞頻度增大，抗原901的捕捉率和熒光標記率提高。反應結束后，洗出未反應的熒光標記抗體。用反應液量的5倍左右的洗滌緩沖液將反應液稀釋后，連同微量管一起插入到集磁用磁性架子中，靜置2分鐘。確認磁微粒已經(jīng)集中到壁面后，為了不吸入上清而將上清全部除去，再加入等量的洗滌緩沖液，將磁微粒懸浮、集磁。將該操作重復實施約5?7次，除去未反應的帶有熒光色素904的抗體902。最后一次除去洗滌緩沖液后，濃縮至欲導入器件的液量，將全部量注入器件。注入時，將對器件施加的磁場806關閉，以使液體均一地散布到器件內(nèi)。確認全部液體都已經(jīng)加入后，打開磁場806。在打開磁場806的狀態(tài)下，確認磁微粒形成膜狀。對于包含器件以及落射型顯微鏡的生物分析裝置的優(yōu)選結構，將在實施例4中詳細說明。將器件放置在自動式臺上，如圖8-(C)所示，由上方的物鏡807照射激發(fā)光，掃描約500個左右的視野，由此可以在幾乎沒有磁微粒903的包圍所致的損失的狀態(tài)下對熒光亮點進行觀察。
[0040]實施例3
[0041]本實施例中，將欲檢測的生物分子為核酸片段時的步驟示于圖10。首先，用磁微粒1002捕捉作為檢測對象的試樣核酸片段1001，再用具有與試樣核酸片段1001互補的序列1003的帶有熒光色素1004的核酸片段1005進行標記。這些為基于雜交的特異性反應，在反應用緩沖液(PBS緩沖液(pH7.4)、50mM?IM NaCU0.1% Tween20)中進行。帶有核酸的磁微粒1002和試樣核酸片段1001、帶有熒光色素1004的核酸片段1005和試樣核酸片段1001的反應何者在先均可，也可以同時進行。核酸片段可以使用單鏈的DNA、RNA。以微小RNA作為具體的解析對象例子來詳細說明。
[0042]微小RNA為20mer左右的單鏈的核酸片段。檢測方法為:首先使作為接頭的核酸序列1003與作為試樣核酸片段1001的微小RNA的3 ‘末端側結合。例如，可以利用20mer的poly A序列。然后，使接頭的互補序列片段1005與熒光色素1004結合。將帶有接頭的互補序列片段1005的熒光色素1004和試樣核酸