一種鑒別奶品品質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品檢驗(yàn)，具體地說(shuō)，涉及一種利用核磁共振鑒別奶品品質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，市場(chǎng)上牛奶、羊奶中摻假廉價(jià)奶（如豆奶）的問(wèn)題備受關(guān)注。另外，在國(guó) 際市場(chǎng)上羊奶比牛奶價(jià)格普遍貴2-5倍，這是由于羊奶的資源相對(duì)牛奶較少，而且奶羊與 奶牛對(duì)生存環(huán)境的要求不同，例如奶牛適宜圈養(yǎng)，以喂食人工飼料為主；而奶羊適宜散養(yǎng)， 以吃青草和干草為主，因此奶羊?qū)χ脖挥幸欢ǖ钠茐男?，一些發(fā)達(dá)國(guó)家已禁止增加奶羊的 數(shù)量。此外，羊奶具有極高的醫(yī)藥價(jià)值、保健價(jià)值及美顏養(yǎng)膚價(jià)值，所生產(chǎn)的產(chǎn)品附加值也 較高，更加減少了市場(chǎng)上食用羊奶的數(shù)量，導(dǎo)致市場(chǎng)上羊奶貨源少、價(jià)格高。羊奶中摻假廉 價(jià)豆奶或牛奶的問(wèn)題尤為突出。為了保障消費(fèi)者的權(quán)益和健康，消除消費(fèi)恐慌，建立牛奶中 摻假豆奶，羊奶中摻假豆奶或牛奶的定量檢測(cè)方法，意義重大。
[0003] 核磁共振技術(shù)在食品成分安全檢測(cè)中發(fā)揮著重大作用，與傳統(tǒng)鑒別牛奶中摻假廉 價(jià)奶的方法相比，該技術(shù)前處理方法簡(jiǎn)單、方便，可通過(guò)一維與二維相結(jié)合的核磁共振技術(shù) 實(shí)現(xiàn)對(duì)牛奶中各代謝物的全面分析，并準(zhǔn)確定量。結(jié)合統(tǒng)計(jì)分析法，找出不同種類奶中各表 征因子，并建立可行性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高的廉價(jià)奶摻假定量模型，可為日后奶品的真實(shí)性鑒別提 供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種鑒別奶品品質(zhì)的方 法。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] -種鑒別奶品品質(zhì)的方法，所述方法包括如下步驟：
[0007] 1)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)奶樣品進(jìn)行預(yù)處理；
[0008] 2)利用一維核磁共振技術(shù)（1H NMR，13C NMR)和二維核磁共振技術(shù)（1H-13C HSQC， 1H-13C HMBC)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)奶樣品中的代謝物進(jìn)行定性和定量分析；
[0009] 3)根據(jù)表征因子含量數(shù)據(jù)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)奶樣品進(jìn)行主成分分析，利用Fisher判別法建 立標(biāo)準(zhǔn)奶樣品的判別模型；
[0010] 所述表征因子包含：檸檬酸、肌酸、卵磷脂、D型乳糖和D型蔗糖；
[0011] 4)配制不同比例的摻假奶樣品，按照步驟1)預(yù)處理方法進(jìn)行預(yù)處理，之后利用1H NMR技術(shù)對(duì)各摻假奶樣品中上述表征因子進(jìn)行定量，利用偏最小二乘法建立多元回歸定量 模型，并測(cè)定其定量限和回收率；
[0012] 5)對(duì)待測(cè)奶樣品進(jìn)行檢測(cè)，按照步驟1)預(yù)處理方法進(jìn)行預(yù)處理，之后利用1H NMR 技術(shù)對(duì)樣品中上述表征因子進(jìn)行定量，將各表征因子的含量數(shù)據(jù)帶入步驟3)所得模型中 可判別樣品的種類，再將各表征因子含量數(shù)據(jù)帶入步驟4)所得模型中可判別是否摻假廉 價(jià)奶，且可定量出摻假廉價(jià)奶的比例。
[0013] 進(jìn)一步地，所述標(biāo)準(zhǔn)奶為純牛奶、純羊奶和豆奶。
[0014] 進(jìn)一步地，步驟1)中預(yù)處理的具體方法為：
[0015] 取5~10份奶樣，加入10~20份無(wú)水乙醇蝸旋混勾；離心取上層溶液用氮?dú)獯?干；加入2~4份重水進(jìn)行水浴超聲，渦旋混勻重新溶解樣品，離心取上層溶液，供下一步檢 測(cè) 。
[0016] 其中，所述重水含1~5mM的內(nèi)標(biāo)物TSP (2, 2, 3, 3-三甲基甲硅烷基丙酸）。
[0017] 其中，離心條件為10000~15000rpm離心10~30min。
[0018] 其中，水浴超聲的條件為20~30°C水浴超聲10~30min。
[0019] 進(jìn)一步地，步驟2)包括：
[0020] I.不同種類奶中各表征因子的定性分析：
[0021] 利用一維核磁共振（1H NMR，13C NMR)和二維核磁共振（1H-13C HSQC，1H-13C HMBC) 技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行分析測(cè)定，并推斷各代謝物的峰歸屬信息。
[0022] 核磁共振儀器型號(hào)需為400MHz或400MHz以上，檢測(cè)溫度為298K ;利用一維（1H NMR，13C NMR)和二維（1H-13C HSQC，1H-13C HMBC)核磁共振技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，技術(shù)參 數(shù)設(shè)置如下：
[0023] 1H NMR參數(shù)如下：數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)，64K ;譜寬，8223. 7Hz ;弛豫時(shí)間，2-4s ;掃描次數(shù)， 8-32 ;采集時(shí)間，4s ;13C NMR參數(shù)設(shè)置如下：數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)，64K ;譜寬，24038. 5Hz ;弛豫時(shí)間， 2_4s ;掃描次數(shù)，1024-2048 ;采集時(shí)間，I. 36s ;
[0024] 1H-13C HSQC參數(shù)設(shè)置如下：數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)，F(xiàn)2為2048, Fl為256 ;譜寬，F(xiàn)2為8223. 7Hz， Fl為24038. 5Hz ;弛豫時(shí)間，2-4s ;掃描次數(shù)，16-64 ;空掃次數(shù)，16-32 ;采集時(shí)間，0. 13s ;
[0025] 1H-13C HMBC參數(shù)設(shè)置如下：數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)，F(xiàn)2為2048, Fl為256 ;譜寬，F(xiàn)2為8223. 7Hz， Fl為24038. 5Hz ;弛豫時(shí)間，2-4s ;掃描次數(shù)，32-128 ;空掃次數(shù)，16-32 ;采集時(shí)間，0. 13s ;
[0026] II.不同種類奶中各表征因子的定量分析：
[0027] 核磁共振圖譜經(jīng)相位調(diào)整和基線校正后，以1~5mM TSP為內(nèi)標(biāo)物，利用以下定量 公式，對(duì)不同種類奶中的表征因子進(jìn)行定量分析（圖1)。
[0028]
[0029] η代表奶樣的濃度倍數(shù);Met代表奶中的代謝物；Ref代表內(nèi)標(biāo)物（例如：TSP)。
[0030] 進(jìn)一步地，步驟3)包括：
[0031] I ·主成分分析：
[0032] 利用one-way ANOVA法分析不同種類奶中代謝物含量差異的顯著性（表1)，找出 不同種類奶的表征因子。根據(jù)各表征因子的含量原始數(shù)據(jù)，對(duì)不同種類牛奶進(jìn)行主成分分 析，結(jié)果表明提取兩個(gè)主成分后，純牛奶、純羊奶、豆奶可以完全區(qū)分開(kāi)，前兩個(gè)主成分的方 差累積貢獻(xiàn)率達(dá)98%。
[0033] 表 1.0 ne-way ANOVA 分析結(jié)果
[0034]
[0035] 代表P〈0. 001 ; bP值是由SPSS 21. 0版軟件計(jì)算所得；。CM代表牛奶；EM代表羊 奶；SM代表豆奶。
[0036] II · Fisher判別模型建立：
[0037] 基于各表征因子的含量原始數(shù)據(jù)，利用Fisher判別法建立純牛奶、純羊奶、豆奶 的判別模型，所得模型如下：
[0038] Y1= 26. 179x !+200. 635x2+245. 065x3+l. 786x4+0. 839x5-413. 914 (I)
[0039] y2= 18. 802x !+209. 010χ2+195· 290χ3+1· 602χ4+0· 726χ5-334· 685 (2)
[0040] y3= 16. 312x !+45· 188χ2+186· 795χ3+0· 064χ4+3· 335χ5_342· 107 (3)
[0041] yi代表牛奶；y 2代表羊奶；y3豆奶。
[0042] X1為檸檬酸含量；x 2為肌酸含量；X 3為卵磷脂含量；X 4為D型乳糖含量；X 5為D型 蔗糖含量，含量單位為mm〇l/L。
[0043] 使用方法：利用核磁共振技術(shù)檢測(cè)待測(cè)奶樣品中上述五種表征因子的含量，將含 量數(shù)值分別代入上述三個(gè)模型，計(jì)算 yi，y2, 73值，三者中的最大值代表待測(cè)奶樣品的種類 (例如Y1, y2, 73中y 2值最大，則代表該待測(cè)奶樣品中主要成分為羊奶）。
[0044] 進(jìn)一步地，步驟4)包括：
[0045] I ·摻假奶樣品配制及預(yù)處理：
[0046] 純牛奶中摻假不同比例的豆奶，牛奶：豆奶（v/v)為1:1至19:1 ;
[0047] 純羊奶中摻假不同比例的豆奶，羊奶：豆奶（v/v)為1:1至19:1 ;
[0048] 純羊奶中摻假不同比例的牛奶，羊奶：牛奶（v/v)為1:1至9:1 ;
[0049] 分別取上述摻假奶樣5~10ml，加入10~20ml無(wú)水乙醇蝸旋混勾；10000~ 15000rpm離心10~30min后，分離上層溶液用氮?dú)獯蹈?；加?~4ml重水（含1~5mM TSP) 20~30°C水浴超聲10~30min，渦旋混勻重新溶解樣品，然后10000~15000rpm離心 10~30min后，取400~600 μ L上層溶液于5mm核磁樣品管中，供下一步檢測(cè)使用。
[0050] II .摻假奶樣品種表征因子的定量分析與摻假定量模型建立：
[0051] 利用核磁共振技術(shù)（1H NMR)對(duì)摻假奶樣品中的檸檬酸、肌酸、卵磷脂、乳糖、蔗糖 進(jìn)行內(nèi)標(biāo)法定量?；跇悠分懈鞅碚饕蜃拥暮吭紨?shù)據(jù)，利用偏最小二乘法建立多元線 性回歸模型，即奶品摻假廉價(jià)奶定量模型。模型如下所示：
[0052] Y1= 0· 071X「Ο. 360Χ3+0· 004Χ5+0· 055(線性范圍：50% -5% ) (4)
[0053] Y2= 0· 026X !-Ο. 434Χ2+0· 004Χ5+0· 513(線性范圍：50% -5% ) (5)
[0054] Y3= -2· 143Χ2+0· 568Χ3+0· 009Χ4+1· 690(線性范圍：80% -10% ) (6)
[0055] Y1為牛奶中摻假豆奶的比例（v/v，％ );
[0056] Y2為羊奶中摻假豆奶的比例（v/v，％ );
[0057] Y3為羊奶中摻假牛奶的比例（v/v，％ );
[0058] X1S檸檬酸含量；X 2為肌酸含量；X 3為卵磷脂含量；X 4為D型乳糖含量；X 5為D型 蔗糖含量，含量單位為mm〇l/L。
[0059] 使用方法：利用核磁共振技術(shù)檢測(cè)待測(cè)奶樣品中上述五種表征因子的含量，將含 量數(shù)值分別代入模型（1)、（2)、（3)中，比較 71、72、73值，其中最大值所代表的種類為待測(cè) 奶樣品所屬類別。再將五種表征因子的含量數(shù)值根據(jù)所判的待測(cè)奶樣品的類別，帶入模型 (4)、（5)、(6)中某一對(duì)應(yīng)奶樣類別的模型中，計(jì)算所得Y值為摻假某種廉價(jià)奶的比例。例 如：若經(jīng)模型（1)、（2)、（3)判定后，y 2值最大，則該待測(cè)奶樣中羊奶占主要成分，再將表征 因子含量數(shù)據(jù)帶入羊奶對(duì)應(yīng)的摻假判別模型（5)和（6)中，即可判斷該羊奶中是否摻假豆 奶或牛奶，Y 2值代表?yè)郊俣鼓痰谋壤?，Y3值則代表?yè)郊倥Ｄ痰谋壤Ｈ鬥 2、Y3值為〇,則表 示該羊奶中沒(méi)有摻假豆奶或牛奶。
[0060] 與傳統(tǒng)技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：
[0061] 本發(fā)明采用的樣品前處理方法簡(jiǎn)單、方便，極大提高了檢測(cè)效率；采用一維和二維 核磁共振技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了樣品中各表征因子結(jié)構(gòu)及含量的全面分析，極大提高了樣 品檢測(cè)的準(zhǔn)確率；采用Fisher判別法建立的判別模型，