用于評(píng)價(jià)前列腺癌進(jìn)度的分析方法、前列腺癌進(jìn)度的評(píng)價(jià)方法、前列腺癌的檢測(cè)方法以及 ...的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及用于評(píng)價(jià)前列腺癌進(jìn)度的分析方法、前列腺癌進(jìn)度的評(píng)價(jià)方法、前列 腺癌的檢測(cè)方法、用于評(píng)價(jià)前列腺癌進(jìn)度的檢查試劑盒、以及用于檢測(cè)前列腺癌的檢查試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 已知前列腺特異抗原（PSA)是一種激肽釋放酶（Kallikrein) -3,其從1969年被發(fā) 現(xiàn)（非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)、1994年被食品藥品管理局（FDA)認(rèn)可為PSA檢查以來(lái)，被認(rèn)為是前列腺 癌的最佳診斷手段（非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。實(shí)際上，在美國(guó)，1年內(nèi)在4400萬(wàn)50歲以上的男性中 至少有70%接受PSA檢查。但是，在2011年10月，美國(guó)予防醫(yī)學(xué)服務(wù)工作組（USPSTF)發(fā) 布了有關(guān)前列腺癌的臨床結(jié)果在統(tǒng)計(jì)上的證據(jù)，主張不要再繼續(xù)對(duì)健康的男性進(jìn)行PSA檢 查（非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。該結(jié)論單純是基于以下考慮：相對(duì)于前列腺癌患者的整體生存率而言 PSA檢查的好處還沒(méi)有達(dá)到需要冒著擴(kuò)大侵襲性的前列腺活組織檢查的事例數(shù)以及擴(kuò)大醫(yī) 療費(fèi)用的風(fēng)險(xiǎn)的程度。預(yù)估為了預(yù)防1個(gè)人患前列腺癌而死亡，卻要在PSA篩查中花掉520 萬(wàn)美元（非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)。
[0003] 至今，本領(lǐng)域一直在探索PSA以外的前列腺癌生物標(biāo)記候補(bǔ)。例如，非專(zhuān)利文獻(xiàn)5 中記載：根據(jù)從患前列腺疾病的患者采集前列腺組織進(jìn)行免疫染色的研究，神經(jīng)肽Y(NPY) 以及巨噬細(xì)胞抑制因子I(MIC-I)在前列腺上皮內(nèi)腫瘤（PIN)患者及前列腺癌患者的前列 腺組織中表達(dá)的情況較多。另外，專(zhuān)利文獻(xiàn)1記載了編碼NPY的mRNA量，在前列腺腫瘤組 織中比在正常的前列腺組織中多。
[0004] 〔現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)〕
[0005] 專(zhuān)利文獻(xiàn)
[0006] 〔專(zhuān)利文獻(xiàn)1〕日本公表專(zhuān)利公報(bào)"日本特表2005-523727號(hào)公報(bào)（2005年8月11 日公表）"
[0007] 非專(zhuān)利文獻(xiàn)
[0008] 〔非專(zhuān)利文獻(xiàn) I〕Ablin，R. J.，Pfeiffer，L.，Gonder，M. J.，and Soanes， ff. A. (1969), Experimental medicine and surgery 27,406-410.
[0009] 〔非專(zhuān)利文獻(xiàn) 2〕Catalona，W. J.，Smith，D. S.，Ratliff，T. L.，Dodds，K.M.，Coplen， D. E. , Yuan, J. J. , Petros, J. A. , and Andriole, G. L. (1991), The New England journal of medicine 324,1156-1161.
[0010] 〔非專(zhuān)利文獻(xiàn) 3〕Chou，R.，Croswell，J. M.，Dana，T.，Bougatsos，C.，Blazina，I.， Fu，R.，Gleitsmann，K.，Koenig，H. C.，Lam，C.，Maltz，A.，Rugge，J. B.，and Lin，K. (2011)， Annals of internal medicinel55,762-771.
[0011] 〔非專(zhuān)利文獻(xiàn) 4〕Brett，A. S.，and Ablin，R. J. (2011)，The New England journal of medicine 365,1949-1951.
[0012] 〔非專(zhuān)利文獻(xiàn) 5〕Krishan K. Rasiah，James G. Kench，Margaret Gardiner-Garden， Andrew V. Biankin, David Golovsky, Phillip C. Brenner, Raji Kooner，Gordon F. 0' Neill，Jennifer J. Turner, ffarick Delprado, C.Soon Lee, David A. Brown, Samuel N. Breit,John J. Grygiel, Lisa G. Horvath,Phillip D. Strieker, Robert L. Sutherland, and Susan M. HenshalI, (2006)，Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006 ； 15 (4), 711-716.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 〔發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題〕
[0014] 如上所述，PSA在臨床上作為前列腺癌的生物標(biāo)記使用。但是，為了減少前列腺癌 的過(guò)度診斷帶來(lái)的上述危險(xiǎn)，強(qiáng)烈希望開(kāi)發(fā)能夠有效對(duì)PSA的低特異性予以彌補(bǔ)的檢測(cè)方 法。
[0015] 另外，目前為止前列腺癌進(jìn)度評(píng)價(jià)只能夠通過(guò)在進(jìn)行了侵襲性高的活組織檢查 后，根據(jù)病理性檢查鏡像來(lái)主觀判斷。如果在血液檢查階段等早期階段就能夠判斷前列腺 癌進(jìn)度，則可大大地減少患者的負(fù)擔(dān)，并且可使用客觀標(biāo)準(zhǔn)確定迅速的治療方針。因此，期 待開(kāi)發(fā)能夠極早進(jìn)行的評(píng)價(jià)前列腺癌進(jìn)度的方法。
[0016] 予以說(shuō)明，雖然非專(zhuān)利文獻(xiàn)5中記載了前列腺組織中NPY的表達(dá)量，但是對(duì)于NPY 在其它的試料（血液及尿液等）中的存在量，沒(méi)有任何公開(kāi)。對(duì)于各蛋白質(zhì)而言，其在組織 中的表達(dá)量與其在其它試料中的存在量并不相關(guān)，這是公知的。而且，非專(zhuān)利文獻(xiàn)5中公開(kāi) 前列腺組織中的NPY表達(dá)量與前列腺癌進(jìn)度不相關(guān)。另外，專(zhuān)利文獻(xiàn)1中也沒(méi)有記載NPY 的肽量與前列腺癌進(jìn)度之間的關(guān)系。而且，非專(zhuān)利文獻(xiàn)5及專(zhuān)利文獻(xiàn)1中都沒(méi)有記載靈敏 度及特異性的驗(yàn)證數(shù)據(jù)。
[0017] 本發(fā)明就是鑒于上述問(wèn)題而完成的發(fā)明，其目的在于提供一種用于評(píng)價(jià)前列腺癌 進(jìn)度的分析方法、前列腺癌進(jìn)度的評(píng)價(jià)方法、以及能夠有效地對(duì)PSA的低特異性予以彌補(bǔ) 的前列腺癌的檢測(cè)方法等。
[0018] 〔用于解決技術(shù)問(wèn)題的手段〕
[0019] 本發(fā)明的用于評(píng)價(jià)前列腺癌進(jìn)度的分析方法包含測(cè)定試料中的神經(jīng)肽Y的量的 工序，所述試料來(lái)自從生物體采集的血液或尿液。
[0020] 本發(fā)明的前列腺癌的檢測(cè)方法包含測(cè)定試料中的神經(jīng)肽Y的量及前列腺特異抗 原量的工序，所述試料來(lái)自從生物體采集的血液或尿液。
[0021] 本發(fā)明的前列腺癌進(jìn)度的評(píng)價(jià)方法包含測(cè)定試料中的神經(jīng)肽Y的量的工序，所述 試料來(lái)自從生物體采集的血液或尿液。
[0022] 本發(fā)明的檢查試劑盒的一實(shí)施方式是用于評(píng)價(jià)前列腺癌進(jìn)度的檢查試劑盒，其包 含用于測(cè)定試料中的神經(jīng)肽Y的量的肽探針，所述試料來(lái)自從生物體采集的血液或尿液。
[0023] 本發(fā)明的檢查試劑盒的另一實(shí)施方式是用于評(píng)價(jià)前列腺癌進(jìn)度的檢查試劑盒，包 含用于測(cè)定試料中的神經(jīng)肽Y的量的抗體，還包含以下至少一方：用于測(cè)定試料中的前列 腺特異抗原的量的抗體或肽探針、用于測(cè)定試料中的TMPRSS2:ERG的mRNA的量的核酸探針 或核酸引物、以及用于測(cè)定試料中的PCA3RNA的量的核酸探針或核酸引物，所述試料來(lái)自 從生物體采集的血液或尿液。
[0024] 本發(fā)明的檢查試劑盒的又一實(shí)施方式是一種用于檢測(cè)前列腺癌的檢查試劑盒，包 含用于測(cè)定試料中的神經(jīng)肽Y的量的抗體或肽探針、以及用于測(cè)定試料中的前列腺特異抗 原的量的抗體或肽探針，所述試料來(lái)自從生物體采集的血液或尿液。
[0025] 本說(shuō)明書(shū)包含本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)即日本專(zhuān)利申請(qǐng)2013-061094號(hào)的說(shuō)明書(shū)以 及/或圖面中記載的內(nèi)容。
[0026] 發(fā)明的效果
[0027] 本發(fā)明能提供一種用于評(píng)價(jià)前列腺癌進(jìn)度的分析方法、前列腺癌進(jìn)度的評(píng)價(jià)方 法、以及可有效地對(duì)PSA的低特異性予以彌補(bǔ)的前列腺癌的檢測(cè)方法等。
【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1是表示實(shí)施例中的RefinerMS software的整體工作流程的圖。
[0029] 圖2是表示實(shí)施例中的QUEST-MS技術(shù)的概要以及由QUEST-MS技術(shù)得到的純化結(jié) 果的圖。
[0030] 圖 3 表不實(shí)施例中的由 Expressionist proteome server 通過(guò) Absent/Present Search法得到的前列腺癌的生物標(biāo)記的篩查結(jié)果。
[0031] 圖4是表示實(shí)施例中的有關(guān)NPY的免疫組織化學(xué)染色解析結(jié)果的圖。
[0032] 圖5是表示實(shí)施例中的在生物標(biāo)記的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)中使用的有關(guān)NPY的MRM條件優(yōu)化 的圖。
[0033] 圖6是表示實(shí)施例中的基于MRM評(píng)價(jià)NPY測(cè)定量的再現(xiàn)性的圖。
[0034] 圖7是表示實(shí)施例中的、NPY (MRM色譜的面積）、PSA (通過(guò)醫(yī)院中的ELISA測(cè)定的 值）、或NPY+PSA (邏輯曲線回歸值）的各ROC曲線的比較圖。
[0035] 圖8是表示實(shí)施例中的、由ROC曲線解析來(lái)評(píng)價(jià)診斷潛在性的圖。
[0036] 圖9是表示實(shí)施例中手術(shù)前及手術(shù)后的樣品中血漿NPY水平的結(jié)果的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 本申請(qǐng)發(fā)明者這次獨(dú)自開(kāi)發(fā)了在生物標(biāo)記的探索中有用的QUEST-MS (Qui ck Enrichment of Small Targets for Mass Spectrometry)技術(shù)。并且，為了鑒定前列腺癌 的生物標(biāo)記而應(yīng)用QUEST-MS技術(shù)。其結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肽Y(NPY)與前列腺癌進(jìn)度具有高 度的相關(guān)性，并且發(fā)現(xiàn)NPY能夠有效地對(duì)PSA的低特異性予以彌補(bǔ)，最終完成了本發(fā)明。
[0038] 〔1.用于評(píng)價(jià)前列腺癌進(jìn)度的分析方法以及前列腺癌進(jìn)度的評(píng)價(jià)方法〕
[0039] 本發(fā)明的用于評(píng)價(jià)前列腺癌進(jìn)度的分析方法包括測(cè)定來(lái)自從生物體采集的血液 或尿液的試料中的神經(jīng)肽Y(NPY)量的工序。
[0040] 本發(fā)明的前列腺癌進(jìn)度的評(píng)價(jià)方法包括測(cè)定來(lái)自從生物體采集的血液或尿液的 試料中NPY量的工序。
[0041] 本發(fā)明的分析方法以及評(píng)價(jià)方法優(yōu)選包含測(cè)定NPY量的工序以及測(cè)定前列腺特 異抗原（PSA)、TMPRSS2: ERG 的 mRNA 以及 PCA3 (prostate cancer antigen3 ;prostate cancer gene 3)RNA中至少一方的量的工序。本發(fā)明的分析方法以及評(píng)價(jià)方法更優(yōu)選包括 測(cè)定NPY量的工序以及測(cè)定PSA的量的工序。
[0042] 予以說(shuō)明，以下將本發(fā)明中測(cè)得的多肽（NPY及PSA)統(tǒng)稱(chēng)為"前列腺癌標(biāo)記肽"。 另外，以下將本發(fā)明中測(cè)得的RNA (TMPRSS2 :ERG的mRNA以及PCA3RNA)統(tǒng)稱(chēng)為"前列腺癌標(biāo) 記RNA"。另外，將"前列腺癌標(biāo)記肽"及"前列腺癌標(biāo)記RNA"統(tǒng)稱(chēng)為"前列腺癌標(biāo)記"。
[0043] "前列腺癌標(biāo)記肽"不僅包括上述多肽的全長(zhǎng)，還包括其片斷，還包括上述多肽的 前體。即，例如"測(cè)定NPY的量"是指測(cè)定全長(zhǎng)的NPY多肽、NPY多肽的片斷以及NPY多肽的 前體中的至少一種。要測(cè)定其量的NPY可以為例如NPY 1 ^NPY1 2S、NPY29 97、NPY6S 97、NPY29 67或 陬￥29 64。另外，也可以為它們的分解物。另外，還可以為陬￥3147、陬￥54 61、陬￥688?；蜈睿?188、 或包含這些中任一部分的全長(zhǎng)NPY或NPY片斷。
[0044] "前列腺癌標(biāo)記RNA"中不僅包括上述RNA的全長(zhǎng)，也包括其片斷，也包括RNA的 前體。予以說(shuō)明，TMPRSS2: ERG為T(mén)MPRSS2基因與ERG基因的融合mRNA。TMPRSS2: ERG的 TMPRSS2與ERG的融合方式?jīng)]有特別的限定，可以舉出例如文獻(xiàn)：Jianghua Wang，Yi Cai， Chengxi Ren，and Michael Ittmann，Cancer Res 2006 ;66 :8347-8351.中記載的方式。 PCA3RNA為PCA3基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，為未編碼（non-coding) RNA。
[0045] 特別的是，在前列腺癌患者的血清中會(huì)檢測(cè)到與健康人的血清相比更多的上述前 列腺癌標(biāo)記肽。因此，特別是通過(guò)測(cè)定血清中的前列腺癌標(biāo)記肽的存在量，再與健康人的存 在量相比，可測(cè)出前列腺癌。另外，特別的是，上述前列腺癌患者的尿液中與健康人的尿液 相比，能夠檢測(cè)到更多的前列腺癌標(biāo)記RNA。因此，特別是通過(guò)測(cè)定尿液中的前列腺癌標(biāo)記 RNA的存在量，再與健康人的存在量相比較，可測(cè)出前列腺癌。
[0046] 進(jìn)而，NPY相對(duì)于前列腺癌的特異性優(yōu)良，且其量與前列腺癌進(jìn)度高度相關(guān)（參照 后述實(shí)施例），因此，特別優(yōu)選作為用于評(píng)價(jià)前列腺癌進(jìn)度的生物標(biāo)記。
[0047] 在此，"前列腺癌"是指包括腺癌（前列腺腺癌）在內(nèi)的前列腺產(chǎn)生的惡性腫瘤。
[0048] "進(jìn)度"是指基于格里森評(píng)分（Gleason Score) (GS)、TNM分