：取1. 42邑胞2冊〇4、0. 96g巧樣酸，然后加入d地2〇至50血，即得；
[005引洗脫液的配制方法示例：將木瓜蛋白酶用抑8. 0, 0.Imol/L化is-肥I緩沖液配 制成l-2mg/mU再加入Immol/L二硫蘇糖醇值TT)37°C解育30min，得洗脫液；
[005引上樣緩沖液可由如下比例的組分配制而成：Tris-肥1 :1%漠酪藍(lán)：(1地20:甘氨酸 =15. 5 :2. 5 :7 :25,其中Tris-肥1的抑為6. 8、摩爾濃度為1M;
[0054] 電泳緩沖液的配制方法如下：取3.Og化is、14. 4g甘氨酸、溶于SOOmLd地2〇中，調(diào) 抑至8. 3后，定容至1L;
[0055] 與低密度脂蛋白特異結(jié)合的物質(zhì)、抗捕獲低密度脂蛋白的物質(zhì)可W是同一 種物質(zhì)，可通過購買得到，在本發(fā)明中選用為英國Abeam公司生產(chǎn)的"型號為Abeam 油 157795 "的Anti-LDL抗體。
[0056] 可捕獲金屬儒離子的物質(zhì)（抗儒離子抗體）為購買自己傲德生物技術(shù)公司 度ioWorldInc)貨號BNA0008。
[0057] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種儒-低密度脂蛋白馨合物，其是由儒離子通過鋒 指結(jié)構(gòu)、琉基、半脫氨酸殘基中的至少一種結(jié)構(gòu)與低密度脂蛋白馨合形成。
[0058] 具體地，儒-低密度脂蛋白馨合物是由儒離子通過鋒指結(jié)構(gòu)、琉基、半脫氨酸殘基 中的至少一種結(jié)構(gòu)與低密度脂蛋白上的載脂蛋白B或膽固醇、甘油=醋等馨合形成。
[0059] 本發(fā)明還提供如上所述的儒-低密度脂蛋白馨合物的制備方法，其包括W下步 驟：
[0060] 1)低密度脂蛋白的合成步驟：
[0061] 在人源低密度脂蛋白中加入儒離子進(jìn)行馨合反應(yīng)；
[0062] 2)低密度脂蛋白的純化步驟：
[0063] 采用免疫親和層析去除步驟1)獲得的儒-低密度脂蛋白馨合物中未參與反應(yīng)的 低密度脂蛋白及儒離子，即得儒-低密度脂蛋白馨合物。
[0064] 所述步驟2)中包括W下步驟：
[0065] A.將步驟1)制得的LDkCd馨合物復(fù)溶于生理鹽水中，得到復(fù)溶液；
[0066] B.平衡層析柱：使用緩沖液沖洗層析柱，將能夠與LDL特異性結(jié)合的填料裝柱后， 然后用緩沖液平衡層析柱；
[0067] C.上樣：上樣前，用稀釋緩沖液稀釋復(fù)溶液，然后上樣，LDkCd馨合物、未與Cd反 應(yīng)的LDL均吸附在填料上，未反應(yīng)的儒離子隨緩沖液流出；
[0068]化洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0. 1M的化2冊〇4 溶液進(jìn)行洗脫稀釋緩沖液；
[0069]E.收集：收集洗脫液；收集完畢后立即使蛋白復(fù)性；
[0070]F.將收集到的洗脫液裝入透析袋用d地2〇透析除鹽，換水2~4次后，4°C透析過 夜，收集透析袋內(nèi)的樣本；
[0071] G.平衡層析柱：使用緩沖液沖洗新的層析柱，將能夠與儒離子特異性結(jié)合的填料 裝柱后，用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0072] H.上樣：上樣前，稀釋緩沖液稀釋樣本，然后上樣；
[0073] I.洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1. 0M的化2冊〇4 溶液進(jìn)行洗脫稀釋緩沖液；
[0074] J.收集：收集洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性；
[00巧]K.透析：將加入復(fù)原液后的洗脫液裝入透析袋用d地2〇透析除鹽，換水=次后， 4°C透析過夜，收集透析袋內(nèi)的樣本，得到純化的儒-低密度脂蛋白馨合物。
[0076] 上述方法還包括步驟3):對LDkCd馨合物的鑒定步驟：
[0077]I.制備膠床：選擇瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠、SDS-聚丙締酷胺凝膠中的一種 作為介質(zhì)，制備膠床；
[0078]II.加樣：取步驟2)制得的儒-低密度脂蛋白馨合物，加入上樣緩沖液并混合均 勻，然后加樣于樣品槽中；
[007引III.電泳：連接電泳板進(jìn)行電泳；
[0080]IV.復(fù)溶檢測：在膠床上找出含儒的蛋白條帶，將該條帶取出并溶解，然后利用 ICP-MS法或AAS法檢測該液體中是否含有儒W及儒含量。
[0081] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上所述的儒-低密度脂蛋白馨合物作為對照品的 試劑盒。
[0082] 優(yōu)選地，該試劑盒還包括包被液，該包被液含有捕獲LDL的物質(zhì)。
[0083] 在本發(fā)明中，能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的試劑盒可W列出W下幾種，但并不限于此。
[0084] -種用于檢測儒-低密度脂蛋白馨合物的試劑盒，包括：含有可捕獲低密度脂蛋 白的物質(zhì)的包被液、封閉液、洗涂液、作為二抗的可W捕獲金屬Cd的物質(zhì)、酶標(biāo)抗體、底物、 終止液、樣品緩沖液、陽性對照、陰性對照等。
[0085] -種用于檢測儒-低密度脂蛋白馨合物的試劑盒，包括：含有可捕獲低密度脂蛋 白的物質(zhì)的包被液、封閉液、洗涂液、洗脫液等。
[0086] -種用于檢測儒-低密度脂蛋白馨合物的試劑盒，包括：含有可捕獲低密度脂蛋 白的物質(zhì)的包被液、封閉液、洗涂液、洗脫液、硝酸、過氧化氨等。
[0087] -種用于檢測儒-低密度脂蛋白馨合物的試劑盒，包括：用于提純血液低密度脂 蛋白所需溶液、復(fù)溶液、含有可捕獲金屬Cd的物質(zhì)的包被液、封閉液、洗涂液、酶標(biāo)抗體、底 物、終止液、樣品緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照等。
[0088] -種用于檢測儒-低密度脂蛋白馨合物的試劑盒，包括：用于提純血液低密度脂 蛋白所需溶液、復(fù)溶液等。
[0089] -種用于檢測儒-低密度脂蛋白馨合物的試劑盒，包括用于提純血液低密度脂蛋 白所需溶液、復(fù)溶液、硝酸、過氧化氨等。
[0090] 一種用于檢測儒-低密度脂蛋白馨合物的試劑盒，包括用于提純血液低密度脂蛋 白所需溶液、膠床介質(zhì)、復(fù)溶液、加樣緩沖液、溶解膠床上含儒的蛋白條帶所需液體、含有可 捕獲金屬Cd的物質(zhì)的包被液、封閉液、洗涂液、酶標(biāo)抗體、底物、終止液、樣品緩沖液、標(biāo)準(zhǔn) 品、陰性對照等。
[0091] 一種用于檢測儒-低密度脂蛋白馨合物的試劑盒，包括用于提純血液低密度脂蛋 白所需溶液、膠床介質(zhì)、復(fù)溶液、加樣緩沖液、溶解膠床上含儒的蛋白條帶所需液體、陽性對 照、陰性對照等。
[0092] 一種用于檢測儒-低密度脂蛋白馨合物的試劑盒，包括用于提純血液低密度脂 蛋白所需溶液、膠床介質(zhì)、復(fù)溶液、加樣緩沖液、溶解膠床上含儒的蛋白條帶所需液體、酸化 劑、過氧化氨、陽性對照、陰性對照等。
[0093] 上述試劑盒中，所述陽性對照為標(biāo)準(zhǔn)品，即馨合有重金屬儒-低密度脂蛋白馨合 物或儒-BSA馨合物；所述陰性對照為不含有標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋洗脫液。所述酶標(biāo)抗體為含有 辣根過氧化物酶、堿性憐酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種，所述用于提純血液低密度脂蛋白 所需溶液為PEG溶液、棚酸鹽緩沖液中的一種；所述膠床介質(zhì)為瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝 膠、SDS-聚丙締酷胺凝膠中的一種，所述標(biāo)準(zhǔn)品或陽性對照為本發(fā)明所述的個儒-低密度 脂蛋白馨合物。
[0094] 本發(fā)明還提供了一種定量檢測儒-低密度脂蛋白馨合物的方法，W已知含量的 上述的儒-低密度脂蛋白馨合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用W下方法之一對樣品進(jìn)行檢測：酶聯(lián)免 疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純 LDkCd馨合物與酶聯(lián)免疫法、提純LDkCd馨合物與原子吸收光譜結(jié)合法、提純LDkCd馨合 物與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感禪合等離子體 質(zhì)譜結(jié)合法。在本發(fā)明中，用檢測儒馨合型免疫復(fù)合物的方法可W列出的有W下幾種，但并 不限于W下幾種。
[0095] 方法一:酶聯(lián)免疫巧LISA)法檢測儒-低密度脂蛋白馨合物，按W下步驟進(jìn)行檢 測：
[0096] 1)將前面所述的可W捕獲低密度脂蛋白的蛋白，如抗LDL抗體蛋白包被于固相載 體上：用稀釋緩沖液W1:250~2000的比例稀釋包被蛋白，加入化ISA板微孔中，4°C下過 夜16-18小時，或37°C水浴1-3小時，儲存冰箱；
[0097] 2)封閉：移去稀釋緩沖液，并用洗涂液進(jìn)行洗涂，待洗涂完成后，加入封閉液， 37°C放置1小時，移去封閉液，并用洗涂液進(jìn)行洗涂；洗涂完成后，ELISA板于37°C放置1 小時；
[009引扣加待檢樣品，并且溫育：從循環(huán)系統(tǒng)中取樣，作待檢樣品；W已知含量的儒-低 密度脂蛋白馨合物作標(biāo)準(zhǔn)樣品；用稀釋緩沖液稀釋樣品至10~40倍，加入微孔中，37°C作 用1-2小時；
[0099] 4)加入抗Cd抗體，并且溫育：移去待檢樣品，并用相應(yīng)洗涂液進(jìn)行洗涂，待洗涂完 成后，加入用稀釋緩沖液W1:12500~100000的比例稀釋的抗Cd抗體，37°C作用1-2小時， 使其與低密度脂蛋白上的金屬儒反應(yīng)；
[0100] 5)酶結(jié)合物溫育：移去抗Cd抗體，并用洗涂液進(jìn)行洗涂，待洗涂完成后，加入用稀 釋緩沖液稀釋的酶標(biāo)抗體（如HRP酶標(biāo)抗體），37°C作用1-2小時，使其與抗Cd抗體反應(yīng)；
[0101] 6)底物溫育：移去酶標(biāo)抗體，并用洗涂液進(jìn)行洗涂，待洗涂完成后，加入底物， 37°C下避光作用30min;
[0102] 7)終止反應(yīng)：滴加終止液至每一微孔；
[0103] 8)加完終止液后，取450nm波長，并從化ISA試劑板中洗脫的溶液中取0. 5mL液體 在酶標(biāo)儀上分別讀取待測樣品組和標(biāo)準(zhǔn)樣品的0D值，通過與標(biāo)準(zhǔn)樣品組比較，求得待測樣 品中儒-低密度脂蛋白馨合物的含量。
[0104] 該方法利用酶聯(lián)免疫吸附測定巧LISA)原理，可w將血清中的低密度脂蛋白提取 出來，提取出來的低密度脂蛋白上部分馨合有重金屬儒，而運(yùn)部分低密度脂蛋白上的儒可 W被抗儒的特異性抗體所捕獲，之后可W再被辣根過氧化物酶、堿性憐酸酶等酶標(biāo)記的抗 體所捕獲（...