一種人源性尿液Endocan蛋白的ELISA檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種人源性尿液化docan蛋白的 ELISA檢測試劑盒及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Endocan即內(nèi)皮素，又稱為內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1(endothelialceU-specific molecule1，ESM-1)，是分子量為50KDa的可溶性蛋白多糖，由165個氨基酸的蛋白內(nèi)核和 連接在137位絲氨酸殘基的硫酸軟皮膚素鏈組成。在人類其基因定位于5號染色體長臂 近端區(qū)域巧qll. 2)，具有3個外顯子和2個內(nèi)含子。Endocan已證實在人血管內(nèi)皮細(xì)胞、 肝細(xì)胞、腎小管上皮等組織細(xì)胞中表達(dá)。其主要功能與血管新生、腫瘤細(xì)胞生長、炎癥反應(yīng) 相關(guān)。近來研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)血管內(nèi)皮生長因子A(VEGF-A)刺激，Endocan可W介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的 遷移。體外細(xì)胞實驗及小鼠體內(nèi)實驗均證實，Endocan過表達(dá)可W促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。干 擾Elndocan表達(dá)可W抑制癌細(xì)胞增殖（Overexpressionofendothelialcellspecific molecule-l巧SM-1)ingastriccancer)。研究還證實，Endocan可W與人白細(xì)胞CDlla/ CD18整合素（淋己細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1，LFA-1)結(jié)合，抑制其與細(xì)胞粘附因子l(ICAM-l) 結(jié)合。
[0003] 已有研究證實化docan參與了某些人體內(nèi)常見惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，并且 血清中化docan含量可作為某些腫瘤的診斷及預(yù)后標(biāo)準(zhǔn)物。與正常組織相比，Endocan在 肺癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、宮頸癌、腎癌、腦膠質(zhì)瘤、膀脫癌等多種癌組織中明顯高表 達(dá)。已通過免疫組化證實，膀脫癌組織中化docan表達(dá)量與膀脫癌惡性程度相關(guān)。與健康 人群血清化docan含量（26. 82+10. 8化g/ml)相比，肝細(xì)胞癌患者血清中化docan含量 (87. 30+25. 69pg/ml)明顯升高，并且其含量與癌癥分期密切相關(guān)。Endocan診斷肝細(xì)胞 癌的特異性可達(dá)80. 8%，敏感性可達(dá)83. 8%。在早期大腸癌患者中，血清化docan含量低 的患者5年生存率為100%，而血清化docan高的患者5年生存率為80%，有顯著統(tǒng)計學(xué) 差異。巧SM-1 regulates cell growth and metastatic process through activation of NF-kB in colorectal cancer)。研究證實，晚期胃癌患者中血清化docan含量明顯高 于早期胃癌（87. 23+15. Ivs. 80. 25+15. 6pg/ml，P=0.018)，且含量高者5年生產(chǎn)率明顯 降低（P<〇. 001)。（Overexpression of endothelial cell specific molecule-1 (ESM-1) in gastric cancer)。在膀脫癌研究中，浸潤性膀脫癌患者血漿化docan含量明顯（平均 0. 79ng/mL)明顯高于健康對照人群（平均0. 43ng/mL)。W〇.43ng/mL作為截斷值，血漿 Endocan診斷浸潤性膀脫癌敏感性為64%，特異性可達(dá)80%。
[0004] 此外，Endocan還參與全身炎癥反應(yīng)，并可作為脈毒癥的診斷和預(yù)后的標(biāo)志 物。研究報道脈毒癥患者血清化docan含量化71 ± 4. 88ng/mL)明顯高于健康人群 (0. 77 + 0. 44ng/mL)，且在脈毒癥休克的患者中含量最高化11 + 12. 9化g/m)。巧ndocan，a newendothelialmarkerinhumans巧sis)。在導(dǎo)致多器官衰竭的嚴(yán)重脈毒癥患者中，血 清化docan含量明顯高于非多器官功能衰竭脈毒癥患者（p<0. 05)，其預(yù)測脈毒癥轉(zhuǎn)歸效果 好于降巧素原、器官序貫衰竭評分（SOFA)等傳統(tǒng)指標(biāo)。 陽0化]上述研究表明化docan在腫瘤和炎癥中發(fā)揮了重要作用，其定量檢測可用于相關(guān) 疾病的診斷和預(yù)后判斷。
[0006]W往對化docan表達(dá)的定量研究主要是采集患者和對照人群的靜脈血液，用 ELISA檢測血清中化docan的含量。然而，靜脈采血是一種有創(chuàng)性操作，會導(dǎo)致患者疼痛、暈 針，甚至有感染及傳播疾病的風(fēng)險。患者依從性差。采集樣品量少。不僅如此，靜脈采血需 要消毒器材、靜脈針、肝素化或含邸TA試劑的專用采血管等設(shè)備，更需要受過培訓(xùn)的專業(yè) 醫(yī)護(hù)人員，成本高、用時長。而尿液，作為人體一種自然排出的體液，可W避免上述血液樣品 的缺點。具有患者無痛苦，無操作相關(guān)并發(fā)癥，采集不需要專業(yè)醫(yī)護(hù)人員，可采集量大，方便 快捷等多種優(yōu)勢，是理想的人體樣品來源。經(jīng)查閱，目前對尿液中化docan蛋白定量檢測國 內(nèi)外尚屬空白。
[0007] 尿液蛋白需由腎臟濾過膜透過或泌尿系統(tǒng)細(xì)胞裂解、分泌產(chǎn)生，往往濃度較低。尿 液中化docan蛋白因濃度較低，采用傳統(tǒng)的用于血液的化ISA檢測試劑盒無法實現(xiàn)定量檢 巧。。因此，建立尿液中Endocan蛋白檢測試劑盒及檢測方法可為其作為無創(chuàng)性診斷和預(yù)后 標(biāo)志物的研究奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引發(fā)明人購買了市場上測血清化docan蛋白ELISA檢測試劑盒，用W檢測人源性尿 液Endocan蛋白，發(fā)現(xiàn)有W下問題：1.試劑盒適用范圍不包括尿液，亦沒有尿液樣品的處理 方法；2.按照現(xiàn)有試劑盒的樣品處理方法檢測不出人源性尿液化docan蛋白的濃度；3.現(xiàn) 有試劑盒在化docan濃度在0. 3-lOng/ml范圍時最準(zhǔn)確，人源性尿液化docan蛋白多低于 此濃度。
[0009]本發(fā)明的目的是提供一種人源性尿液Endocan蛋白的ELISA檢測試劑盒及檢測方 法。本發(fā)明旨在為檢測臨床和實驗室樣品中人源性尿液化docan蛋白含量提供準(zhǔn)確、簡便、 靈敏度高、并可被廣泛使用的檢測手段。 陽010] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下： W11] 本發(fā)明利用超濾和化ISA技術(shù)建立了檢測人源性尿液化docan蛋白的試劑盒，并 首次證實在某些病理狀態(tài)下人的尿液中存在化docan。
[001引本發(fā)明第一方面，提供了一種人源性尿液化docan蛋白的化ISA檢測試劑盒，主要 包括：
[0013] 內(nèi)管量程為5ml的10KD截斷值的超濾離屯、管。
[0014] 捕獲抗體，小鼠抗人源性化docan抗體；
[0015] 檢測抗體，生物素標(biāo)記的小鼠抗人源性化docan的抗體；
[0016] 標(biāo)準(zhǔn)蛋白，為重組人化docan蛋白；
[0017] 辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈菌素；
[0018] 所述的試劑盒，還包括有：
[0019] 碳酸氨鋼緩沖液、PBS緩沖液、96孔酶標(biāo)板、顯色液和終止液。
[0020] 所述的試劑盒，96孔酶標(biāo)板為市售的化ISA酶標(biāo)板，較優(yōu)地，可選用丹麥NUNC公司 的Maxiso巧系列化ISA酶標(biāo)板（96孔，#44-2404)。
[002U 捕獲抗體，小鼠抗人源性化docan抗體，可選用法國Lunginnov公司的LIK-1101
[0022] 檢測抗體，生物素標(biāo)記的小鼠抗人化docan抗體，可選用法國Lunginnov公司的 LIK-1101；
[0023] 重組人化docan標(biāo)準(zhǔn)蛋白可選用法國Lunginnov公司的LIK-1101;
[0024] 碳酸氨鋼緩沖液為0. 1M，pH= 9. 6 ; 陽0巧]PBS緩沖液為含 0. 1 %BSA，5mM邸TA，0. 1 %Tween20 的 1XPBS溶液；
[0026] 顯色液，四甲基聯(lián)苯胺底物；
[0027] 終止液，較優(yōu)的為2mol/L的硫酸溶液。
[0028] 本發(fā)明的第二方面，是提供人源性尿液化docan蛋白的檢測方法，其特征在于，先 將采集的人尿液樣品進(jìn)行離屯、，再將上清液超濾濃縮10-20倍，然后用優(yōu)化的化ISA技術(shù)檢 測人源性尿液化docan蛋白。
[0029] 該方法具體包括W下步驟：
[0030] 室溫下，用碳酸氨鋼緩沖液稀釋捕獲抗體至2yg/mU用每孔100y1該捕獲抗體 溶液包被96孔酶標(biāo)板，4°C過夜解育。
[0031] 移除捕獲抗體溶液，酶標(biāo)板每孔加入300y1PBS緩沖液，洗涂3遍。移除PBS緩 沖液，每孔再加入300y1PSA緩沖液后室溫封閉1小時。封閉后，酶標(biāo)板每孔加入300y1 PBS緩沖液，洗涂3遍。
[0032]用PBS緩沖液制備lOng/ml, 5ng/ml, 2. 5ng/ml, 1. 25ng/ml,0.625ng/ml,0.31 化g/ ml,0.156ng/ml，化g/ml等8個梯度濃度的重組人化docan標(biāo)準(zhǔn)品溶液
[0033] 超純水洗涂超濾離屯、管。5ml超純水加入超濾離屯、管內(nèi)管，4°C離屯、4000Xg(水平 離屯、機(jī)）或7500Xg(固定角度離屯、機(jī)），5分鐘。棄去內(nèi)管和外管超純水。
[0034] 采集人尿液樣品后1小時內(nèi)予W4°C離屯、lOOOXg，10分鐘。將離屯、后上清l-5ml 加入洗涂后的超濾離屯、管內(nèi)管。4°C離屯、4000Xg(水平離屯、機(jī)）或7500Xg(固定角度離 屯、機(jī)），15分鐘。記錄內(nèi)管剩余液體體積。計算超濾后原液濃縮倍數(shù)。 W35]W100yl/孔的體積將上述處理過的人尿液樣品及8個梯度濃度的重組人Endocan標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入上述處理過的酶標(biāo)板各孔，室溫解育1小時。較優(yōu)地，解育時可輕 度振蕩。
[0036] 移除各孔中的液體，每孔加入PBS緩沖液300y1，洗涂3次，甩干；加入將生物素 標(biāo)記的小鼠抗人化docan的抗體0. 2yg/ml，每孔100y1，室溫解育1小時；移除各孔中的 液體，加入PBS緩沖液，每孔300y1，洗涂3次，甩干；加入HRP標(biāo)記的鏈菌素，每孔100y1， 室溫避光解育30分鐘；移除各孔中的液體，加入PBS緩沖液，每孔300y1，洗涂3次，甩干； 加入底物四甲基聯(lián)苯胺底物，每孔100y1，室溫避光解育10分