基于氣液界面單細胞捕獲及葉綠素熒光表征的單微藻細胞活性動態(tài)監(jiān)測新方法與裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基于氣液界面單細胞捕獲及葉綠素熒光表征單藻細胞活性動態(tài)監(jiān)測技術(shù)，特別是關(guān)于基于氣液界面單細胞捕獲及葉綠素熒光表征單藻細胞活性動態(tài)監(jiān)測新方法與裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]微藻是一類古老的低等植物，廣泛地分布在海洋、淡水湖泊等水域。近年來，隨船舶壓載水傳播的外來生物的入侵已在世界范圍內(nèi)造成嚴重的環(huán)境污染和巨大的經(jīng)濟損失，微藻作為外來生物中的主要生物之一，也受到越來越多的關(guān)注。而且，微藻細胞中含有多種高價值的營養(yǎng)成分和化工原料，藻類已經(jīng)越來越多的被利用到實驗當中。目前，用于檢測微藻活性的方法主要有:光學顯微鏡法、染料熒光顯微鏡法、流式細胞儀法、分子及生化方法等。
[0003]光學顯微鏡法是用細胞固定液固定從水中分離出來浮游植物細胞，在顯微鏡下直接觀察浮游植物細胞的形態(tài)，根據(jù)細胞不同的形態(tài)來判斷微藻細胞的活性。這種方法要求實驗人員必須具備豐富的水生生物學知識，能鑒定識別常見藻類并判斷活性，人為因素影響和誤差較大，而且工作強度大、效率低。
[0004]染料熒光顯微鏡法通過對微藻樣品進行熒光染料的染色，熒光染料與微藻體內(nèi)某些活性物質(zhì)(如DNA等)結(jié)合，根據(jù)所染熒光強度來判斷微藻的活性。這種方法克服了人為觀察微藻活性的缺點，一定程度上提高了準確性；然而每種染料根據(jù)各自染色機理的不同，只能對某些藻成立，普適性差，并且染色過程繁瑣，需要具有專業(yè)知識的人員進行染色，染色過程易受外界各種因素干擾，某些染料本身存在毒性。
[0005]流式細胞儀法了用熒光染料標記微藻細胞并將其制成的懸液，利用流式細胞儀測量通過激光照射區(qū)域的懸浮溶液中微藻細胞的熒光信號和散射光信號，通過這些信號判斷微藻的活性。這種方法工作效率高，具有快速準確的優(yōu)點，但是商用流式細胞儀價格昂貴、體積龐大，樣前處理繁瑣，操作復雜，另外，藻類活性的判斷依然依靠熒光染料進行，熒光染料存在的缺點仍未得到解決。
[0006]分子及生化方法，主要包括:核酸雜交技術(shù)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)、基因芯片技術(shù)、DNA指紋技術(shù)、酶活性分析等。該方法具有檢測靈敏度高的優(yōu)點。其缺點是:對于微藻體積測量無能為力，所需設(shè)備昂貴、笨重，基本采用收集樣品后拿回實驗室進行培養(yǎng)鑒定，耗時費力，效率不高，并且進行檢測的種類也相對有限。
[0007]上述檢測方法檢測對象往往是一細胞群體，這往往會模糊個體細胞間存在的差異，統(tǒng)計平均結(jié)果不能十分準確地反映單個藻細胞活性變化的真實情況。為了更好地解析細胞生物學特性，開發(fā)用于研究單個細胞的技術(shù)勢在必行。
[0008]實現(xiàn)單個細胞檢測的前提是細胞的捕獲及固定?，F(xiàn)有的細胞捕獲技術(shù)主要借助于電場力、介電力、靜壓力、磁場力等操縱手段實現(xiàn)對細胞的靈活操縱，并將細胞捕獲在微流控芯片通道特定的位置。
[0009]電場力捕獲細胞是通過反復切換一組低電壓，使帶電的細胞在電場力作用下不斷改變流速和方向，最終沉降至微通道底部并貼壁，這樣可以控制細胞捕獲在十字交叉口附近一定范圍內(nèi)。
[0010]介電力捕獲細胞是利用介電泳力將單個細胞捕獲在微電極點陣上，當單個細胞被捕獲在電極中間而占據(jù)了介電泳力最大的位置時，其余細胞由于介電泳力較小而被流動的溶液沖走。
[0011]靜壓力捕獲細胞是細胞在流體壓力作用下向前運動并被側(cè)通道的液流帶到捕獲單細胞的位置，單個細胞被捕獲在側(cè)通道口，阻止主通道液流向該方向流動，則其余細胞會被主通道液流帶至下一個細胞捕獲口，從而形成陣列單細胞捕獲。
[0012]磁場力捕獲細胞是利用磁場力在芯片內(nèi)吸附帶有特定抗體的磁珠，通過磁珠和細胞的相互作用完成對細胞的捕獲。
[0013]這些細胞捕獲方法往往需要外接復雜的設(shè)備，樣前處理繁瑣，操作步驟復雜，不能做到快速便捷的捕獲單個藻細胞，不利于后續(xù)的單個微藻細胞活性檢測工作的進行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明要提供一種利用界面張力來捕獲單個微藻細胞的技術(shù)及葉綠素熒光表征的單微藻細胞活性動態(tài)監(jiān)測新方法與裝置。
[0015]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)發(fā)案如下:基于氣液界面單細胞捕獲及葉綠素熒光表征的單微藻細胞活性動態(tài)監(jiān)測新方法與裝置，它包括單個微藻細胞捕獲單元和單個微藻細胞活性動態(tài)監(jiān)測單元。單個微藻細胞捕獲單元用于為微藻細胞檢測提供平臺，并從流過捕獲區(qū)域的多個微藻細胞中捕獲單個微藻細胞。單個微藻細胞活性動態(tài)監(jiān)測單元用于檢測單個微藻細胞捕獲單元捕獲到的單個微藻細胞的葉綠素熒光信號，并將檢測到的熒光信號轉(zhuǎn)換為電信號，對電信號進行放大、濾波、降噪，并通過數(shù)據(jù)處理組件對檢測到的信號進行采集、處理，從而將單個微藻細胞的葉綠素熒光信號在顯示器上清楚地顯示出來。
[0016]所述單個微藻細胞捕獲單元包括氣泡發(fā)生裝置與微流控芯片組件。所述氣泡發(fā)生裝置包括數(shù)字注射栗、注射器和密封導管。所述數(shù)字注射栗由步進電機及其驅(qū)動器、絲桿和支架等構(gòu)成，具有往復移動的絲桿、螺母，螺母與所述注射器的活塞相連，所述密封導管與所述注射器的注射口相連接。所述微流控組件包括微流控芯片承載平臺、微流控芯片。所述微流控芯片包括進樣口、出樣口、注氣口、通道和細胞捕獲區(qū)域。所述注氣口與所述密封導管的另一端相連接。所述進樣通道兩端分別設(shè)有進樣口和出樣口，所述進樣通道上設(shè)有與其垂直且相通的進氣通道，所述進氣通道上設(shè)有注氣口，所述注氣口與密封導管的另一端相連接；所述進樣通道和進氣通道的交接處形成細胞捕獲區(qū)域。
[0017]所述單個微藻細胞活性動態(tài)監(jiān)測單元包括激光光源、熒光檢測組件、紅光濾光片、穩(wěn)壓直流電源、數(shù)據(jù)處理組件和數(shù)據(jù)傳輸及顯示組件。所述熒光檢測組件主要由光電反射陰極、電子光學輸入系統(tǒng)、電子倍增系統(tǒng)、電子收集極、全封閉式擋光外殼及支架組成。所述激光光源與支架固定在一起，所述熒光檢測組件的陰陽極與所述穩(wěn)壓直流電源相連接，所述熒光檢測組件的輸出端與所述數(shù)據(jù)處理組件相連接，所述數(shù)據(jù)處理組件與所述數(shù)據(jù)傳輸及顯示組件相連接，所述紅光濾光片安裝在所述全封閉式擋光外殼的上表面。
[0018]進一步地，在上述技術(shù)方案中，所述微流控芯片承載平臺為載玻片。
[0019]進一步地，在上述技術(shù)方案中，所述進樣通道寬度為200um。
[0020]進一步地，在上述技術(shù)方案中，所述進氣通道寬度為200um。
[0021]基于氣液界面單細胞捕獲及葉綠素熒光表征的單微藻細胞活性動態(tài)監(jiān)測新方法與裝置的操作方法，包括以下步驟:
[0022]①.將所制作好的微流控芯片放在倒置顯微鏡下，將其與氣泡發(fā)生裝置連接好。
[0023]②.在微流控芯片內(nèi)注入配制好的緩沖液，打開注射栗，靠壓力在微流控芯片捕獲區(qū)域附近打出一氣泡。
[0024]③.將微藻(鹽藻、扁藻及其他生理活性相似的藻類)細胞懸浮液注入微流控芯片的通道中，控制注射栗的速度，當微藻細胞流經(jīng)捕獲區(qū)域時，使氣泡與微藻細胞充分碰撞，由于表面張力的存在，單個微藻細胞會吸附在氣泡上。
[0025]④.成功捕獲細胞后，將微流控芯片放在微流控芯片承載平臺上，將其固定在單個微藻細胞活性動態(tài)監(jiān)測單元上。
[0026]⑤.打開單個微藻細胞活性動態(tài)監(jiān)測單元上的各項開關(guān)，對捕獲的單個微藻細胞進行檢測。
[0027]⑥.數(shù)據(jù)處理組件對檢測結(jié)果進行信號提取、采集和處理，并將結(jié)果顯示在顯示屏上。
[0028]進一步地，在上述技術(shù)方案中，所述緩沖溶液為磷酸緩沖溶液1XPBS。
[0029]發(fā)明有益效果
[0030]1、由于本發(fā)明采用微流控芯片作為檢測微藻活性的檢測平臺，相關(guān)的光電檢測組件和數(shù)據(jù)處理組件體積較小，相對于大型貴重的檢測設(shè)備，本發(fā)明具有結(jié)構(gòu)簡單、操作容易以及便攜化等特點；
[0031]2、相對于以往需借助于電場力、介電力、靜壓力、磁場力以及空間等操縱手段實現(xiàn)對細胞的捕獲，本發(fā)明利用氣液界面實現(xiàn)對單個細胞的快速捕獲，不僅克服了傳統(tǒng)方法具有的設(shè)備復雜，操作繁瑣、效率不高等缺點，而且簡化了微流控芯片的通道結(jié)構(gòu)，具有更強的實用性和更寬廣的應(yīng)用領(lǐng)域；
[0032]3、本發(fā)明采用激光誘導葉綠素熒光的方法檢測靜止的微藻細胞的活性，克服了以往在檢測前對微藻樣品進行染色的方法所帶來的缺點，具有工作量少、準確度高的特點；
[0033]4、本發(fā)明實現(xiàn)了單個微藻細胞的活性動態(tài)監(jiān)測，這是細胞檢測領(lǐng)域的一大進步。現(xiàn)有對藻細胞活性分析的方法，通常都是是從所用樣品中的細胞群體中獲得統(tǒng)計平均結(jié)果，這樣會模糊個體細胞間存在的差異，統(tǒng)計平均結(jié)果不能十分準確地反映單個藻細胞活性變化的真實情況。單細胞分析能更好地解析細胞生物學特性，供許多新的生物學信息，對于研究細胞之間的結(jié)構(gòu)和性能、生命活動的規(guī)律和本質(zhì)、基礎(chǔ)醫(yī)學和藥物研發(fā)都具有重要的意義。
【附圖說明】
[0034]圖1為單個微藻細胞捕獲單元的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0035]圖2為微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖