一種獼猴桃莖黃酮類hplc指紋圖譜建立及其指紋圖譜的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品藥品管理領(lǐng)域，尤其涉及一種獼猴桃莖黃酮類HPLC指紋圖譜建 立及其指紋圖譜。
【背景技術(shù)】
[0002] 中藥指紋圖譜特指中藥樣本經(jīng)光譜或色譜等現(xiàn)代分析技術(shù)得到的中藥各組分群 體特征的圖譜或圖像。中藥指紋圖譜作為一種綜合的、可量化的質(zhì)量控制手段，目前，已被 眾多國際性醫(yī)藥機(jī)構(gòu)所承認(rèn)，已成為中成藥、天然藥物質(zhì)量控制最有效的方法之一。美國食 品藥品管理局在1996年制定的《FDA關(guān)于植物制品的指南》中，要求對植物原料、植物藥中 間品和植物藥產(chǎn)品提供相應(yīng)的指紋圖譜。英國草藥典、印度草藥典以及加拿大藥用及芳香 植物學(xué)會、德國藥用植物學(xué)會也接受色譜指紋圖譜。中國國家藥品監(jiān)督管理部門于2000年 發(fā)布了《中藥注射劑的指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》，明確要求對新申報的中藥注射 劑和已上市的中藥注射劑實行指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)。中藥指紋圖譜經(jīng)過了數(shù)十年的研究，使用了 包括紫外、紅外、氣相、高效液相、薄層、核磁共振、掃描電子顯微鏡、計算機(jī)圖像分析、電泳 技術(shù)、同功酶分析法、分子生物學(xué)技術(shù)、聚類分析技術(shù)等許多現(xiàn)代分析測試手段，為中藥的 物質(zhì)鑒定和成分分析積累了大量的數(shù)據(jù)。但從中藥全面質(zhì)量控制的角度看，還遠(yuǎn)未達(dá)到有 效地反映和控制中藥的整體質(zhì)量的目的。高效液相色譜（HPLC)指紋圖譜在國際上容易獲 得認(rèn)可，包括美國、英國、法國、加拿大、德國、日本和印度在內(nèi)的許多國家更愿意接受HPLC 指紋圖譜。因此，為中藥材建立相應(yīng)的HPLC指紋圖譜，是現(xiàn)階段控制中藥內(nèi)在質(zhì)量的有效 手段。四川是獼猴桃最大的主產(chǎn)區(qū)之一，其根，藤梨根，作為解毒抗癌藥材在《江西草藥》、 《湖南藥物志》、《浙江民間常用草藥》、《福建民間草藥》、《閩東本草》、《陜西中草藥》中都有記 載，報道根中先后分離出糖類、三萜、黃酮等化合物；另具調(diào)查，由于根資源有限，目前中藥 材市場購進(jìn)的藤梨根90%以莖充根。從獼猴桃栽培看，每年入冬有大量修枝，莖葉、疏花廢 棄；因此建立枝條、葉、花有效成分指紋圖譜，是既解決質(zhì)量評價方式單一，不足以系統(tǒng)、完 整地表明藥材的整體質(zhì)量，亟需探索更先進(jìn)、更有效的質(zhì)量控制手段問題；又能使獼猴桃資 源充分利用。
[0003] 目前獼猴桃枝條、葉、花黃酮類指紋圖譜未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種獼猴桃莖黃酮類HPLC指紋圖譜建立及其指紋圖譜， 旨在得到的獼猴桃枝條、葉、花、藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，彌補(bǔ)現(xiàn)有藥材質(zhì)量控制技術(shù)不夠完善 和科學(xué)的不足。
[0005] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種獼猴桃莖黃酮類HPLC指紋圖譜建立方法，所述的獼猴 桃莖黃酮類HPLC指紋圖譜建立方法采用高效液相色譜法，具體的步驟如下：
[0006] 步驟一，供試品溶液的制備，采用粉碎的陰干獼猴桃莖葉、花蕾、美味根，加入甲 醇，過濾和清洗，取續(xù)濾液作為供試品溶液；
[0007] 步驟二，對照品溶液的制備，精密稱取蘆丁對照品和槲皮苷對照品，加50 %甲醇制 成每1ml各含0. 12mg的混合溶液，搖勻，即得；
[0008] 步驟三，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以0. 2 %磷酸水 溶液為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為254nm ;
[0009] 步驟四，分別精密吸取對照品溶液10 μ 1與供試品溶液10 μ 1，柱溫為35°C，注入 液相色譜儀，測定，即得，以蘆丁和槲皮苷分別計算出總黃酮含量，最終結(jié)果以平均值計。 [0010] 進(jìn)一步，所述供試品溶液的制備方法具體包括：將陰干獼猴桃莖葉、花蕾、美味根， 粉碎為40目，分別稱取藥材粉各4.0克，加40ml甲醇，稱定重量，加熱回流提取60min，放 冷，用甲醇補(bǔ)齊重量，過濾，將容器和濾渣用甲醇分別清洗若干次，將濾液和清洗液合并，用 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，再用3ml甲醇溶解并清洗容器，合并后過0. 45um孔徑微孔濾膜，取續(xù)濾液 作為供試品溶液。
[0011] 進(jìn)一步，所述梯度洗脫以如下體積濃度配置進(jìn)行：
[0012] 0分鐘時，流動相A為5 %的乙腈溶液，流動相B為95 %的0. 2 %磷酸水溶液；
[0013] 15分鐘時，流動相A為10%的乙腈溶液，流動相B為90%的0. 2%磷酸水溶液；
[0014] 40分鐘時，流動相A為20 %的乙腈溶液，流動相B為80 %的0. 2 %磷酸水溶液；
[0015] 45分鐘時，流動相A為90%的乙腈溶液，流動相B為10%的0. 2%磷酸水溶液；
[0016] 55分鐘時，流動相A為90%的乙腈溶液，流動相B為10%的0. 2%磷酸水溶液；
[0017] 56分鐘時，流動相A為5 %的乙腈溶液，流動相B為95 %的0. 2 %磷酸水溶液；
[0018] 68分鐘時，流動相A為5 %的乙腈溶液，流動相B為95 %的0. 2 %磷酸水溶液。
[0019] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種獼猴桃莖黃酮類HPLC指紋圖譜，獼猴桃莖黃酮 類HPLC指紋圖譜的建立，具體包括如下：
[0020] 步驟一，供試品溶液的制備，采用粉碎的陰干獼猴桃莖葉、花蕾、美味根，加入甲 醇，過濾和清洗，取續(xù)濾液作為供試品溶液；
[0021] 步驟二，對照品溶液的制備，精密稱取蘆丁對照品和槲皮苷對照品，加50 %甲醇制 成每1ml各含0. 12mg的混合溶液，搖勻，即得；
[0022] 步驟三，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以0. 2 %磷酸水 溶液為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為254nm ;
[0023] 步驟四，分別精密吸取對照品溶液10 μ 1與供試品溶液10 μ 1，柱溫為35°C，注入 液相色譜儀，測定，即得，以蘆丁和槲皮苷分別計算出總黃酮含量，最終結(jié)果以平均值計；
[0024] 確定了 17個共有特征峰；
[0025] 1號峰，平均保留時間RT為6. 6min，RSD為2%，峰面積為113, RSD為0. 57% ;
[0026] 2號峰，平均保留時間RT為8. 8min，RSD為9%，峰面積為825, RSD為4. 17% ;
[0027] 3號峰，平均保留時間RT為11. 3min，RSD為1%，峰面積為157, RSD為0· 79% ;
[0028] 4號峰，平均保留時間RT為16. lmin，RSD為1 %，峰面積為354, RSD為1. 79% ;
[0029] 5號峰，平均保留時間RT為17. lmin，RSD為3%，峰面積為320, RSD為L 62% ;
[0030] 6號峰，平均保留時間RT為21. 5min，RSD為0%，峰面積為1515, RSD為7. 66% ;
[0031] 7號峰，平均保留時間RT為24. 3min，RSD為6%，峰面積為530, RSD為2. 68% ;
[0032] 8號峰，平均保留時間RT為26. Omin，RSD為5%，峰面積為579, RSD為2. 92% ;
[0033] 9號峰，平均保留時間RT為29. Omin，RSD為5%，峰面積為231，RSD為L 17% ;
[0034] 10號峰，平均保留時間RT為30. 2min，RSD為4%，峰面積為831，RSD為4. 20% ;
[0035] 11號峰，平均保留時間RT為31. lmin，RSD為4%，峰面積為1044, RSD為5. 28%;
[0036] 12號峰，平均保留時間RT為32. 2min，RSD為1%，峰面積為201，RSD為1. 02% ;
[0037] 13號峰，平均保留時間RT為34. Omin，RSD為1 %，峰面積為54. 83, RSD為0· 27%;
[0038] 14號峰，平均保留時間RT為35. Omin，RSD為0%，峰面積為171，RSD為0. 86% ;
[0039] 15號峰，平均保留時間RT為36. 9min，RSD為5%，峰面積為1640, RSD為8. 29% ;
[0040] 16號峰，平均保留時間RT為43. Omin，RSD為5%，峰面積為304, RSD為1. 53% ;
[0041] 17號峰，平均保留時間RT為43. 7min，RSD為4%，峰面積為831，RSD為4. 20%。
[0042] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0043] 獼猴桃根（藤梨根，軟棗獼猴桃根）用作敗毒抗癌、清熱消腫藥材，在我國已有上 千年歷史，但隨著野生資源的枯竭出現(xiàn)藥材斷層，中藥材市場常用獼猴桃枝條冒充根，魚目 混雜，質(zhì)量難以保證。本項目指紋圖譜研究，可將不同品種、不同部位（枝條、花、根）與軟 棗獼猴桃根進(jìn)行比較，通過比較其共有峰，證明枝條是根的延伸部位，具有同源同質(zhì)屬性， 而花與枝條、根之間細(xì)微差異也能凸顯；通過獼猴桃黃酮類指紋圖譜建立，可以區(qū)分供替代 藤梨根作藥材的獼猴桃枝條與其它植物根的差別，為獼猴桃枝條替代藤梨根藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 的制定奠定基礎(chǔ)。
[0044] 另外本發(fā)明的供試品制作簡便，色譜條件容易實現(xiàn)；方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較好； 適于對獼猴桃枝條、葉、花藥材真?zhèn)?、產(chǎn)地和品質(zhì)的鑒別和控制。
【附圖說明】
[0045] 圖1是本發(fā)明實施例提供的獼猴桃莖黃酮類HPLC指紋圖譜建立方法流程圖；
[0046] 圖2是本發(fā)明實施例提供的枝條中黃酮類具十七個共峰示意圖；
[0047] 圖3是本發(fā)明實施例提供的軟棗獼猴桃根與8個品種枝條提取的黃酮類指紋圖譜 相似度示意圖。
【具體實施方式】
[0048] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0049] 下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
[0050] 參閱圖1 :