利用兔抗雞IgY-納米金免疫散射探針作檢測雞IgY-標準曲線方法及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測雞卵黃免疫球蛋白的方法，具體地指一種利用兔抗雞IgY-納米 金免疫散射探針作檢測雞IgY-標準曲線方法及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞卵黃免疫球蛋白（IgY)來自卵生動物，而現(xiàn)階段研究的大多數(shù)抗原源起哺乳動 物，因而作為卵生動物與哺乳動物相比，對哺乳動物抗原的反應(yīng)度高，特殊抗體形成率高， 因此IgY可作為產(chǎn)生更好抗體來源，在免疫學上具有優(yōu)勢。另外，IgY保健食品的開發(fā)近幾 年來也有研究?？贵wIgY可以與體內(nèi)的病菌抗原相結(jié)合，進而抑制病菌和腸壁細胞接觸的 機會，提供身體被動的免疫能力，來對抗抗原（細菌、病毒及外來蛋白質(zhì)等）對身體的危害。 由于IgY有一定的耐酸能力，可以順利的通過幼體的胃液而不失活。這為開發(fā)IgY保健食品 提供了一定的依據(jù)。此外，由于IgY對口腔變形鏈球菌有抑制作用（王祝玲和王強2008)， 目前已經(jīng)被開發(fā)為抗齲IgY牙膏，國內(nèi)市場已有十分成熟的商品。鑒于IgY在免疫學、醫(yī)學 疾病預(yù)防、食品添加劑及日用品等方面發(fā)揮著重要作用，所以IgY的定量檢測意義顯著。
[0003] 目前，關(guān)于IgY的研究主要集中在IgY的分離純化，免疫效價研究等方面（黃靖和 羅健2002;Palombo et al 1998)，針對定量檢測IgY的研究并不多，已報道的有酶聯(lián)免疫 法、高效液相色譜法和電化學的方法等。但酶聯(lián)免疫法難以做到準確定量檢測（宋宏新等 2004);高效液相色譜法操作復(fù)雜，所用儀器較為昂貴（陳偉峰等2012);電化學方法涉及到 電極制備及檢測物在電極表面的固定，操作較為繁瑣（Bottari et al 2014)。
[0004] 因此開發(fā)一種靈敏性高、試劑耗量小、成本低廉、檢測便捷、易于普及推廣的IgY 定量檢測方法具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題就是提供一種利用兔抗雞IgY-納米金免疫散射探針 制作檢測雞卵黃免疫球蛋白標準曲線的方法及其利用兔抗雞IgY-納米金免疫散射探針快 速檢測雞卵黃免疫球蛋白方法。該方法實現(xiàn)了對痕量IgY的定量分析，具有檢測速度快，靈 敏度高，抗干擾強的特點，并且實驗操作簡單，所用試劑耗量小、成本低，實現(xiàn)了對IgY快速 靈敏檢測，符合現(xiàn)代食品分析檢測的重要發(fā)展趨勢。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種利用兔抗雞IgY-納米金免疫散射探針制作 檢測雞卵黃免疫球蛋白標準曲線的方法，包括以下步驟：
[0007] 1)將兔抗雞IgY抗體（Anti-IgY)加入到納米金溶液（AuNPs)中，攪拌均勾，再加 入聚乙二醇20000,繼續(xù)攪拌得到兔抗雞IgY-納米金免疫散射探針溶液，并置于4°C條件下 保存?zhèn)溆茫?br>[0008] 2)將兔抗雞IgY-納米金（Anti-IgY-AuNPs)免疫散射探針溶液、IgY和PBS緩沖 液進行混合，然后用雙蒸水定容至5mL ;即得到含有不同濃度的IgY的混合溶液，其中，混合 溶液中IgY的濃度為O~200ng/mL ;
[0009] 3)將上述得到含有不同濃度的IgY的混合溶液分別置于熒光分光光度計中進行 同步掃描測定其散射光譜，含有IgY的混合溶液的散射強度I 1，不含IgY的混合溶液原始散 射強度為I。;觀察散射光譜圖的變化；其中，同步掃描設(shè)定為A λ = 〇,即λ Μ= λ
[0010] 4)通過對照原始散射強度I。與加入IgY反應(yīng)后溶液散射強度I 間的散射強度 變化量A I = If〗。，得到IgY濃度與Δ I之間的線性關(guān)系，建立IgY定量檢測方程。
[0011] 進一步地，所述步驟1)中，兔抗雞IgY抗體的濃度為0. 002 mg/mL，納米金溶液的 濃度為47. 8 μ g/mL、pH = 7. 5,聚乙二醇20000的質(zhì)量分數(shù)為3%，其中，
[0012] 所述兔抗雞IgY-納米金免疫散射探針溶液是由將ImL的兔抗雞IgY抗體加入到 IOmL的納米金溶液中，攪拌10~20min，再加入200 μ L的聚乙二醇20000 ;繼續(xù)攪拌15~ 30min得到的。
[0013] 再進一步地，所述步驟2)中，兔抗雞IgY-納米金免疫散射探針溶液的用量為5mL ; PBS緩沖液的pH = 4. 9,濃度為0. 02mol/L，PBS緩沖液的用量為2. 5mL ;八種的混合溶液 中，IgY 的濃度分別為 4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、120ng/mL、160ng/mL 和 200ng/mL〇
[0014] 再進一步地，所述熒光分光光度計為日本島津的RF-5301型熒光分光光度計， 其激發(fā)波長設(shè)定為225nm，發(fā)射波長設(shè)定為225-800nm，激發(fā)和發(fā)射光狹縫寬度均為5nm， Sensitive 設(shè)置為 low，Response time 設(shè)定為 0· 25s〇
[0015] 再進一步地，所述步驟4)中，IgY定量檢測方程為Δ I = 2. 0764C-4. 3059,其中， C 為 IgY 濃度（ng/mL)。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種利用兔抗雞IgY-納米金免疫散射探針快速檢測雞卵黃免疫 球蛋白方法，包括以下步驟：
[0017] 1)將兔抗雞IgY抗體（Anti-IgY)加入到納米金溶液（AuNPs)中，攪拌均勾，再加 入聚乙二醇20000,繼續(xù)攪拌得到兔抗雞IgY-納米金免疫散射探針溶液，并置于4°C條件下 保存?zhèn)溆茫?br>[0018] 2)將兔抗雞IgY-納米金免疫散射探針溶液、IgY和PBS緩沖液進行混合，然后用 雙蒸水定容至5mL ;即得到含有不同濃度的IgY的混合溶液，其中，混合溶液中IgY的濃度 為 0 ~200ng/mL ;
[0019] 3)將上述得到含有不同濃度的IgY的混合溶液分別置于熒光分光光度計中進行 同步掃描測定其散射光譜，含有IgY的混合溶液的散射強度I 1，不含IgY的混合溶液原始散 射強度為I。;觀察散射光譜圖的變化；其中，同步掃描設(shè)定為A λ = 〇,即λ Μ= λ
[0020] 4)通過對照原始散射強度I。與加入IgY反應(yīng)后溶液散射強度I 間的散射強度 變化量A I = If〗。，得到IgY濃度與Δ I之間的線性關(guān)系，建立IgY定量檢測方程；
[0021] 5)將待測物溶解于雙蒸水中，超聲震蕩使待測物充分溶解，離心去除高豐度蛋白， 得到上清液；
[0022] 6)將步驟1)中得到的上清液與0. 5mL的兔抗雞IgY-納米金免疫散射探針溶液和 2. 5mL的PBS緩沖液進行混合均勻，定容至5mL得到待測液；
[0023] 7)利用熒光分光光度計檢測待測液的散射強度，利用上述得到的標準曲線的線性 方程計算出待測物中的IgY含量。
[0024] 再進一步地，所述步驟1)中，兔抗雞IgY抗體的濃度為0. 002mg/mL，納米金溶液的 濃度為47. 8 μ g/mL、pH = 7. 5,聚乙二醇20000的質(zhì)量分數(shù)為3%，其中，
[0025] 所述兔抗雞IgY-納米金免疫散射探針溶液是由將ImL的兔抗雞IgY抗體加入到 IOmL的納米金溶液中，攪拌10~20min，再加入200 μ L的聚乙二醇20000 ;繼續(xù)攪拌15~ 30min得到的。
[0026] 再進一步地，所述步驟2)中，兔抗雞IgY-納米金免疫散射探針溶液的用量為5mL ; PBS緩沖液的pH = 4. 9,濃度為0. 02mol/L，PBS緩沖液的用量為2. 5mL ;八種的混合溶液 中，IgY 的濃度分別為 4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、120ng/mL、160ng/mL 和 200ng/mL〇
[0027] 再進一步地，所述熒光分光光度計為日本島津的RF-5301型熒光分光光度計， 其激發(fā)波長設(shè)定為225nm，發(fā)射波長設(shè)定為225-800nm，激發(fā)和發(fā)射光狹縫寬度均為5nm， Sensitive 設(shè)置為 low，Response time 設(shè)定為 0· 25s〇
[0028] 再進一步地