一種采用透射光譜鑒別水中細(xì)菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水體微生物檢測方法領(lǐng)域，具體是一種采用透射光譜鑒別水中細(xì)菌的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 致病菌污染水體嚴(yán)重威脅飲用水安全和人類健康。當(dāng)前飲用水中的病原微生物污 染，是危害人們健康的最大問題之一。聯(lián)合國衛(wèi)生組織調(diào)查數(shù)據(jù)顯示：人類80%的疾病與 飲用水受到生物污染相關(guān)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于化學(xué)污染致病的比例；每年88%的死亡病例與不潔飲 水和水衛(wèi)生狀況有關(guān)。流行病學(xué)調(diào)查和細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)證明顯示，沙門氏菌、大腸桿菌0157: H7 彎曲桿菌、霍亂弧菌和耶爾森氏菌等腸道致病菌，小球隱孢子蟲、表吮賈第蟲和痢疾變形蟲 等病原微生物的暴發(fā)和流行是威脅飲用水安全和造成人類疾病的主要原因。我國自1986 年至2005年發(fā)生了 152起飲用水污染事故，污染類型以生物污染為主，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于化學(xué)污染 的比例，占69. 1%。
[0003] 目前，對(duì)水中病原菌的檢測仍主要基于選擇性培養(yǎng)法和分子生物學(xué)、免疫學(xué)等標(biāo) 準(zhǔn)的生物化學(xué)法，這些方法鑒定程序繁瑣、鑒別周期長（需3-7天或更長），需專業(yè)人員完 成，且生化方法特異性強(qiáng)，不具有普遍推廣意義，難以實(shí)現(xiàn)快速、在線、實(shí)時(shí)檢測，更不能達(dá) 到全面、連續(xù)的水質(zhì)監(jiān)測預(yù)警。隨著光電檢測技術(shù)的迅速發(fā)展，光譜學(xué)方法成為細(xì)菌鑒別檢 測的主要技術(shù)手段。目前，國內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)已開展多種光譜技術(shù)的細(xì)菌鑒別檢測方法研究， 其中，研究最廣泛的是將傅立葉紅外光譜技術(shù)與化學(xué)計(jì)量學(xué)方法相結(jié)合用于鑒別細(xì)菌，但 是紅外光譜為振動(dòng)光譜，包含的是菌體化學(xué)組分對(duì)紅外光吸收的倍頻和組合頻信息，光譜 信息有嚴(yán)重重疊，直接用于分類鑒別時(shí)數(shù)據(jù)量龐大，需依據(jù)不同種細(xì)菌選擇不同波段光譜 分層建立鑒別模型，建模過程較復(fù)雜，且紅外光譜的方法不適合分析含水樣品，水中的羥基 峰對(duì)紅外測定結(jié)果有較強(qiáng)干擾，因此，限制該鑒別方法的應(yīng)用領(lǐng)域，不適合用于水體細(xì)菌種 類鑒別。為更好的保障飲用水及生活用水的安全，亟需發(fā)展一種快速、高效、操作簡便的水 體細(xì)菌分類鑒別方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種采用透射光譜鑒別水中細(xì)菌的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)存 在的建模過程復(fù)雜、不適用于水中細(xì)菌分類鑒別的缺陷，提供一種快速、高效、操作簡便的 細(xì)菌鑒別方法。。
[0005] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：
[0006] -種采用透射光譜鑒別水中細(xì)菌的方法，其特征在于：包括以下步驟：
[0007] (1)、受試細(xì)菌培養(yǎng)及懸浮液制備：
[0008] 選取水體常見致病菌為研究對(duì)象并選取合適的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)基及相關(guān) 器皿進(jìn)行高溫高壓滅菌，將研究對(duì)象的標(biāo)準(zhǔn)菌樣放入光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行24h~48h靜置活 化培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)置如下：光照2000-30001UX、光暗比14h:10h、培養(yǎng)溫度依據(jù)菌種的最 適宜生長溫度選擇；
[0009] 對(duì)培養(yǎng)的細(xì)菌菌液進(jìn)行離心洗滌處理，制備每種細(xì)菌懸浮液，通過加入去離子水 調(diào)節(jié)細(xì)菌懸浮液濃度，選取懸浮液濃度對(duì)應(yīng)200nm處的光密度值在0. 2-0. 8之間的懸浮液 作為訓(xùn)練集或測試集樣本，每種細(xì)菌懸浮液配置至少10個(gè)不同濃度的樣本，訓(xùn)練集細(xì)菌和 測試集細(xì)菌為不同時(shí)間批次培養(yǎng)的同種細(xì)菌，二者應(yīng)在相同的環(huán)境條件下培養(yǎng)，并使用與 測試集樣本相同的條件和方法制備訓(xùn)練集細(xì)菌懸浮液，訓(xùn)練集和測試集樣本濃度無須完全 相同，選取懸浮液濃度對(duì)應(yīng)200nm處的光密度值在0. 2-0. 8之間的懸浮液樣本作為測試集 均可；
[0010] ⑵、透射光譜采集：
[0011] 以去離子水為參比，將細(xì)菌懸浮液放入紫外可見分光光度計(jì)中進(jìn)行透射光譜測 定，光譜測量范圍為200-900nm，取樣間隔為lnm，掃描速度為中速，每次測量重復(fù)三次取平 均值；
[0012] (3)、細(xì)菌透射光譜分類鑒別模型的建立，包括如下步驟：
[0013] (3. 1)、細(xì)菌透射光譜信息提?。?br>[0014] 對(duì)步驟⑵測量得到的透射光譜進(jìn)行均值歸一化處理，利用歸一化的訓(xùn)練集光譜 數(shù)據(jù)建立細(xì)菌種類鑒別模型，建模過程充分利用整個(gè)測量波段200-900nm中每個(gè)波長處的 光密度值；
[0015] 將細(xì)菌均值歸一化后的透射光譜訓(xùn)練樣本集數(shù)據(jù)記為：
[0016]
[0017]
[0018] 其中，X是nXm維的數(shù)據(jù)矩陣，元=(\2TO，h)W·)是第i個(gè)細(xì)菌樣本歸一化 后的m維光密度數(shù)據(jù)組成的矢量，m為掃描波長總數(shù)且m = 701，n為細(xì)菌懸浮液樣本總數(shù)； ? KH，···,^)是η維類別矢量，1肩細(xì)菌第i個(gè)樣本的類別標(biāo)簽，即第i種細(xì)菌樣本對(duì)應(yīng) 的等級(jí)；
[0019] (3. 2)、內(nèi)部交叉驗(yàn)證：
[0020] 選取基于網(wǎng)格搜索的3折交叉驗(yàn)證方法進(jìn)行內(nèi)部交叉驗(yàn)證，過程如下：
[0021] 將細(xì)菌訓(xùn)練集樣本數(shù)據(jù)X =[.\弋;…:元]和類別矢量f代入基于網(wǎng)格尋優(yōu)的接口 函數(shù)SVMcgForclass，接口函數(shù)SVMcgForclass默認(rèn)進(jìn)行3折交叉驗(yàn)證過程，設(shè)置支持向量 機(jī)懲罰因子C和核函數(shù)參數(shù)g各自的取值范圍，并設(shè)定各自的進(jìn)步步長，進(jìn)行基于網(wǎng)格搜索 的內(nèi)部交叉驗(yàn)證，獲得支持向量機(jī)懲罰因子C和核函數(shù)參數(shù)g的最優(yōu)參數(shù)組合，使模型達(dá)到 最佳分類結(jié)果并具有最優(yōu)的泛化能力；
[0022] (3. 3)、基于支持向量機(jī)細(xì)菌分類鑒別模型的構(gòu)建：
[0023] 支持向量機(jī)的核心是在原始數(shù)據(jù)線性不可分的情況下，利用核函數(shù)變換到高維空 間，對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行線性可分，采用一對(duì)一多分類的支持向量機(jī)方法構(gòu)建細(xì)菌種類鑒別模型， 過程如下：
[0024] 第1步、獲取訓(xùn)練集(.Vi)，(七乂Λ···，(兄,乂) J 為模型建立的訓(xùn)練 集特征矢量，包括細(xì)菌分類所需的全部信息，獲得的Α'=[?;…:元]是線性不可分的，在 支持向量機(jī)建模時(shí)需先選取合適的核函數(shù)進(jìn)行高維變換；
[0025] 第2步、構(gòu)造并求解最優(yōu)化問題：
[0026]
[0027]
[0028]
[0029] 冢為分別是第i，j個(gè)細(xì)菌樣本歸一化后的m維光密度數(shù)據(jù)組成的矢量， yi, I是結(jié)果標(biāo)簽y i, y_j e Y = {1，-1}，A ,_)是核函數(shù)，g是拉格朗日對(duì)偶變量， or,泛二(Orl,%，…成f，. ai，a j是不同的拉格朗日乘子，
[0030] a i，i = 1，…，η, α」，j = 1，…，n，C是一個(gè)參數(shù)，用于控制目標(biāo)函數(shù)中兩項(xiàng)之間的 權(quán)重，即懲罰因子；
[0031] 第3步、計(jì)算
，選擇《的一個(gè)正分量α」，并據(jù)此計(jì)算：
[0032]
[0033] 其中栽b分別是線性超平面的法向量和截距；
[0034] 第4步、把
帶入超平面方程得到判別函數(shù)：
[0035]
[0036] 通過以上支持向量機(jī)分類模型鑒定待測細(xì)菌種類。
[0037] 本發(fā)明采用一種基于光與細(xì)胞體結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子直接作用的 200-900nm多波長紫外可見透射光譜進(jìn)行細(xì)菌分類鑒別，可以實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)單一菌種的分 類鑒別，為研發(fā)實(shí)際水體細(xì)菌分類鑒別技術(shù)提供方法依據(jù)。
[0038] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)為：
[0039] (1)本發(fā)明的方法不僅可用于飲用水源細(xì)菌的快速識(shí)別鑒定，而且可用于食品檢 測等其他領(lǐng)域的細(xì)菌鑒定。
[0040] (2)本發(fā)明的方法將包含細(xì)胞散射、吸收特征的波長范圍200-900nm的透射光譜 與支持向量機(jī)方法結(jié)合起來，能夠?qū)崿F(xiàn)快速鑒別，無需對(duì)待鑒別細(xì)菌進(jìn)行其他分類學(xué)方法 的預(yù)選擇，無需專業(yè)人員完成，無需依據(jù)細(xì)菌種類選擇不同波段建立鑒別模型，是一種簡 便、快速、準(zhǔn)確的細(xì)菌分類鑒別方法。
【附圖說明】
[0041] 圖1為本發(fā)明方法流程圖。
[0042] 圖2為【具體實(shí)施方式】中五種不同光密度的四種細(xì)菌透射光譜圖，其中：
[0043] 圖2a為大腸埃希氏菌菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌200nm 處的光密度值分別為：〇. 632、0. 375、0. 706、0. 291的透射光譜圖，<