ris緩沖液），分別等量加入，充分混合，室溫孵育；
[0088] (5)再加入等量的PEG6000溶液，離心，得到沉淀物；
[0089] (6)沉淀物用500微升ρΗ7· 4的PBS重懸，加入3H閃爍液2 μ L ;
[0090] (7)測量樣品放射量，得到樣品中所含內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度，
[0091] (8)重復(fù)上述操作，步驟⑷羊角拗苷甲依次替換為5nM，10nM，20nM，50nM，0.1 M 和0· 2Μ，同時，將步驟（6)加入3Η閃爍液依次替換成5yL、10yL、20yL、50yL、100yL、 200 μ L，測得數(shù)值繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0092] 結(jié)果顯示，利用此試劑盒測量出獨立胎盤組織中分泌的內(nèi)源性洋地黃樣因子濃 度，單位為ηΜ，此濃度可以被本發(fā)明提供的試劑盒精確測量。
[0093] 實施例5該試劑盒用于測量人體冷凍胎盤組織中內(nèi)源性洋地黃樣因子的含量
[0094] (1)用刀片將冷凍胎盤組織塊切成薄片；
[0095] (2)將組織薄片置于勻漿器中，液氮冷凍1分鐘；
[0096] (3)以1500rpm的速度勾衆(zhòng)5分鐘；
[0097] (4)取出組織勻漿，加等量甲醇，離心去除蛋白；
[0098] (5)將上清液濃縮，保存；
[0099] 測量樣品方法同實施例4中步驟（4)-(7)。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制同實施例4。
[0100] 結(jié)果顯示，此試劑盒可測量冷凍胎盤組織中內(nèi)源性洋地黃樣因子的濃度，樣品來 源均被確診為早癇病發(fā)者。
[0101] 實施例6該試劑盒用于測量人體血清中內(nèi)源性洋地黃樣因子的含量
[0102] 測量方法同實施例4中步驟（4)_(7)。結(jié)果顯示，該試劑盒可以精確測量出人體血 清中低含量的內(nèi)源性洋地黃樣因子。
[0103] 實施例7該試劑盒用于測量胎盤組織中分泌內(nèi)源性洋地黃樣因子的累積
[0104] 方法同實施例4。結(jié)果顯示，隨著組織培養(yǎng)時間的累積，該試劑盒測出人胎盤分泌 的內(nèi)源性洋地黃樣因子含量逐步增加。
[0105] 此結(jié)果進一步證明本發(fā)明提供的試劑盒的精確可靠性，更為重要的是，為今后進 一步研究該因子在人體內(nèi)的生物合成以及生物調(diào)節(jié)打下基礎(chǔ)。
[0106] 對比例1
[0107] 本對比例的試劑盒取自專利CN 103439492 B提供的試劑盒。
[0108] 功能鑒定：
[0109] 將實施例1-3和對比例1的試劑盒進行冷凍，放入-80°C超低溫冰箱中，在不同冷 凍次數(shù)下取以上4種凍存試劑盒，每種取三袋，小心放于冰上緩慢融化，然后利用SDS-聚丙 烯酰胺凝膠電泳法分別測定蛋白質(zhì)的活性，結(jié)果如表1所示。
[0110] 表1蛋白質(zhì)活性測定結(jié)果（η = 3)
LlN 丄U010S404 A i ^ (/ ( }J<
[0113] 從表1可以看出，本發(fā)明的試劑盒經(jīng)過多次反復(fù)凍存，蛋白質(zhì)的活性仍然較高，即 使經(jīng)過20次反復(fù)凍存，蛋白質(zhì)活性仍然保持在90%以上；而對比例的蛋白質(zhì)活性經(jīng)過反復(fù) 凍存下降很快，反復(fù)凍存10次以后基本已經(jīng)不能使用?？梢?，本發(fā)明的試劑盒不僅可以快 速簡單、方便而特異性地測量出樣品中內(nèi)源性洋地黃樣因子的含量，從而穩(wěn)定、可靠而靈敏 地進行孕期子癇的早期診斷；還具有極佳的凍存后復(fù)蘇效果，可經(jīng)解凍復(fù)蘇后直接使用，且 反復(fù)凍存后不影響其活性，便于攜帶、存儲和運輸，保存期長。申請人聲明，本發(fā)明通過上述 實施例來說明本發(fā)明的工藝方法，但本發(fā)明并不局限于上述工藝步驟，即不意味著本發(fā)明 必須依賴上述工藝步驟才能實施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改 進，對本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明 的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種試劑盒，其特征在于，包括以下組份： 一抗地高辛抗體、 二抗鼠抗羊IgG、 3H標(biāo)記羊角拗苷甲、 三羥甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸二鈉的混合溶液、 聚乙二醇6000水溶液、 3H閃爍液；和 含有或者不含有羊角拗苷甲。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述一抗地高辛抗體的濃度為5-15微 克/毫升； 優(yōu)選地，所述二抗鼠抗羊IgG的濃度為4-8X10 7摩爾/升； 優(yōu)選地，所述3H標(biāo)記羊角拗苷甲的濃度為7-17Ci/mmol ; 優(yōu)選地，所述混合溶液中三羥甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸二鈉的質(zhì)量比為1 : (0. 25-0. 75);所述三羥甲基氨基甲烷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13-28% ; 優(yōu)選地，所述聚乙二醇6000水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15-30%。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒用于檢測人體血清、胎 盤組織分泌液以及冷凍胎盤組織中的內(nèi)源性洋地黃樣因子的含量。4. 根據(jù)權(quán)利1-3之一所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒用于檢測檢孕期先兆子 癇和/或子癇。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒用于檢測孕期先兆子癇和 子癇的方法為： ⑴采集胎盤，切成2cmX2cmX2cm大小的組織塊，液氮冷凍，保存于-80°C; ⑵將冷凍胎盤組織塊切成片，置于勻漿器中，放入液氮罐中冷凍1分鐘；以1500rpm的速度將組織薄片勻漿5分鐘； (3) 收集勻漿組織，加入等量的甲醇，混勻，以2000rpm的速度離心5分鐘，去除蛋白； 收集離心上清液，真空濃縮，4°C保存； (4) 取出試劑盒中地高辛抗體、二抗鼠抗羊IgG、3H標(biāo)記羊角拗苷甲、pH= 7. 4的三羥 甲基氨基甲烷緩沖液，分別等量加入，充分混合，室溫孵育； (5) 再加入等量的PEG6000溶液，離心，得到沉淀物； (6) 沉淀物用500yLpH7. 4的PBS重懸，加入3H閃爍液200yL; (7) 測量樣品放射量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中所含內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度； 或者：取孕婦血樣，獲得血清，取出試劑盒中地高辛抗體、二抗鼠抗羊IgG、3H標(biāo)記羊角 拗苷甲、pH= 7. 4的三羥甲基氨基甲烷緩沖液，分別等量加入，充分混合，室溫孵育；再加入 等量的PEG6000溶液，離心，得到沉淀物；沉淀物用500微升pH7. 4的PBS重懸，加入3H閃爍 液200yL;測量樣品放射量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中所含內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法 為： ⑴采集胎盤，切成2cmX2cmX2cm大小的組織塊，液氮冷凍，保存于-80°C; ⑵將冷凍胎盤組織塊切成片，置于勻漿器中，放入液氮罐中冷凍1分鐘；以1500rpm 的速度將組織薄片勻漿5分鐘； (3) 收集勻漿組織，加入等量的甲醇，混勻，以2000rpm的速度離心5分鐘，去除蛋白； 收集離心上清液，真空濃縮，4°C保存； (4) 取出試劑盒中地高辛抗體、二抗鼠抗羊IgG、2nM羊角拗苷甲、pH = 7. 4的三羥甲基 氨基甲烷緩沖液，分別等量加入，充分混合，室溫孵育； (5) 再加入等量的PEG6000溶液，離心，得到沉淀物； (6) 沉淀物用500微升pH7. 4的PBS重懸，加入3H閃爍液200 y L ; (7) 測量樣品放射量，得到樣品中所含內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度； (8) 重復(fù)上述操作，步驟⑷羊角拗苷甲依次替換為5nM，10nM，20nM，50nM，0.1 M和 0? 2M，同時，將步驟（6)加入3H閃爍液依次替換成5yL、10yL、20yL、50yL、100yL、 200 y L，測得數(shù)值繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)療器械技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明公開了一種試劑盒及其檢測方法。該試劑盒包括以下組份：一抗地高辛抗體、二抗鼠抗羊IgG、3H標(biāo)記羊角拗苷甲、聚乙二醇6000、3H閃爍液、三羥甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸二鈉的混合溶液以及含有或者不含有羊角拗苷甲。本發(fā)明試劑盒凍存后復(fù)蘇效果極佳，可經(jīng)解凍復(fù)蘇后直接使用，反復(fù)凍存不影響活性，保存、攜帶都很方便；此外，試劑盒的操作簡單、靈敏度高且特異性強，能夠穩(wěn)定可靠的早期診斷孕期子癇，為之后的治療提供有利依托。
【IPC分類】G01N33/53
【公開號】CN105158454
【申請?zhí)枴緾N201510579964
【發(fā)明人】繆建良
【申請人】無錫市長安曙光手套廠
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年9月11日