一種基于卵黃抗體檢測(cè)磺胺二甲基嘧啶的熒光偏振免疫分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫分析技術(shù)和獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種基于卵黃抗體檢測(cè) 磺胺二甲基嘧啶的熒光偏振免疫分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 磺胺二甲基嘧啶（Sulfamethazine，SM2)是人工合成的廣譜抗菌藥物，對(duì)大多數(shù)革 蘭陽(yáng)性菌感和革蘭陰性菌都具有抑制作用，臨床上主要用于各種溶血性鏈球菌、腦膜炎球 菌以及肺炎球菌等致病菌所引發(fā)的呼吸道感染、腸道感染等細(xì)菌性疾病的治療。因而在畜 牧養(yǎng)殖中廣泛使用，在動(dòng)物性食品中的殘留現(xiàn)象較為嚴(yán)重。且其具有較強(qiáng)的毒性作用，長(zhǎng)期 或者過(guò)量使用可造成泌尿系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等的損傷，甚至有致癌的可能性。我國(guó) 以及歐盟等均規(guī)定動(dòng)物性食品中磺胺類藥物總量和磺胺二甲基嘧啶等單個(gè)磺胺藥物的最 尚殘留限量為100 Ii g/kg。
[0003] 目前，對(duì)磺胺類藥物殘留進(jìn)行檢測(cè)的免疫分析方法主要有酶聯(lián)免疫分析方法和免 疫層析方法，這些方法需要繁瑣的洗滌孵育等步驟，耗時(shí)長(zhǎng)。而且通常使用的單克隆抗體， 不僅成本高，而且對(duì)動(dòng)物傷害大，不能滿足動(dòng)物福利的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有的磺胺二甲基嘧啶檢測(cè)技術(shù)中操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，以 及單克隆抗體產(chǎn)量低，采集時(shí)對(duì)動(dòng)物傷害大等不足，建立一種基于卵黃抗體的磺胺二甲基 嘧啶的熒光偏振免疫檢測(cè)方法。
[0005] 本發(fā)明所提供的基于卵黃抗體檢測(cè)磺胺二甲基嘧啶的熒光偏振免疫分析方法，包 括下述步驟：
[0006] 1)將磺胺二甲基嘧啶的半抗原與熒光素進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，得到熒光標(biāo)記物；
[0007] 2)將一系列已知濃度的磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品的溶液分別與熒光標(biāo)記物溶液以 及卵黃抗體溶液混合，孵育進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，測(cè)定所得體系的熒光偏振值；以測(cè)定的熒光偏振 值為縱坐標(biāo)，所述一系列已知濃度的磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品的溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0008] 3)以待測(cè)樣品代替步驟2)中的磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品的溶液，按照步驟2)中的 加樣量，將所述待測(cè)樣品與所述熒光標(biāo)記物溶液以及所述卵黃抗體溶液混合，孵育進(jìn)行競(jìng) 爭(zhēng)反應(yīng)，測(cè)定所得體系的熒光偏振值，根據(jù)步驟2)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出所述待測(cè)樣品中 磺胺二甲基嘧啶的濃度。
[0009] 上述方法步驟1)中，所述磺胺二甲基啼啶的半抗原可選自下述至少一種：磺胺二 甲基嘧啶（SM 2)、磺胺甲噁唑（SMX)和磺胺甲基嘧啶（SMR)。
[0010] 所述熒光素可選自下述至少一種：異硫氰酸熒光素（FITC)、二氯三嗪基氨基熒光 素（DTAF)以及異硫氰酸熒光素乙二胺衍生物（EDF)。
[0011] 具體地，所述熒光標(biāo)記物具有表1所示的結(jié)構(gòu)。
[0012] 表1各焚光標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)
[0013]
[0014]
[0015] 優(yōu)選的，所述熒光標(biāo)記物為SM2-FITC。
[0016] 步驟2)中，所述一系列已知濃度的磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品的溶液的溶質(zhì)為磺胺 二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品，溶劑為硼酸鹽緩沖液。
[0017] 所述硼酸鹽緩沖液的摩爾濃度為45-55mmol/L，pH值為8. 0-8. 5。
[0018] 所述一系列已知濃度為 0· Ing/mL、lng/mL、5ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、 500ng/mL和 2000ng/mL。
[0019] 所述熒光標(biāo)記物溶液的濃度為工作濃度，所述熒光標(biāo)記物的工作濃度為標(biāo)記物的 熒光值是背景值（緩沖溶液）10倍時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度，為15nM。
[0020] 所述卵黃抗體是以磺胺二甲基嘧啶為免疫原對(duì)雞進(jìn)行免疫制得的。
[0021] 所述卵黃抗體的制備方法如下：利用免疫原對(duì)蛋雞進(jìn)行皮下背部多點(diǎn)免疫，免疫 劑量為〇. 3mL (濃度是lmg/mL)，之后每次間隔2-3周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量減半，免疫次 數(shù)為七次。
[0022] 所述卵黃抗體的工作濃度為抗體結(jié)合曲線中50%的抗體結(jié)合時(shí)的抗體稀釋倍數(shù)， 所述卵黃抗體的工作濃度為〇. 14mg/mL。
[0023] 步驟2)和步驟3)中，所述磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品的溶液、所述熒光標(biāo)記物溶液和 所述卵黃抗體溶液以等體積混合，所述體積具體可為70 μ L-100 μ L，具體可為70 μ L。
[0024] 步驟2)和步驟3)中，所述競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的溫度為20_25°C，優(yōu)選為25°C，時(shí)間為 l_5min，優(yōu)選為 2min〇
[0025] 步驟2)和步驟3)中，所述熒光偏振值的測(cè)定條件為：激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)/ Cutoff 值為：485nm/530nm/515nm。
[0026] 所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制依據(jù)OriginPro 8.0軟件中的四參數(shù)方程進(jìn)行。
[0027] 步驟3)中，所述待測(cè)樣品可為動(dòng)物性食品，具體可為牛奶。
[0028] 所述待測(cè)樣品為牛奶時(shí)，所述待測(cè)樣品在進(jìn)行熒光偏振免疫檢測(cè)之前，經(jīng)過(guò)如下 所述的預(yù)處理：將牛奶進(jìn)行離心處理，傾倒出上層脂肪，加入三氯乙酸，充分混合，離心，收 集上清液，將所述上清液用所述硼酸鹽緩沖液稀釋后直接用于熒光偏振免疫分析（FPIA) 檢測(cè)。
[0029] 上述方法在動(dòng)物性食品中磺胺二甲基嘧啶含量檢測(cè)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
[0030] 所述動(dòng)物性食品具體可為牛奶。
[0031] 本發(fā)明選擇合適的磺胺二甲基嘧啶半抗原與特定的熒光素偶聯(lián)，合成多種熒光標(biāo) 記物；利用卵黃抗體代替?zhèn)鹘y(tǒng)的單克隆和多克隆抗體；利用熒光標(biāo)記物、磺胺二甲基嘧啶 的卵黃抗體以及標(biāo)準(zhǔn)品建立一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)的免疫反應(yīng)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；將待測(cè)樣品與熒光標(biāo) 記物、磺胺二甲基嘧啶的卵黃抗體建立競(jìng)爭(zhēng)的免疫反應(yīng)，測(cè)量得到的體系的熒光偏振值，根 據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)樣品中的磺胺二甲嘧啶的濃度。
[0032] 本發(fā)明的有益效果是：
[0033] 現(xiàn)有的磺胺二甲基嘧啶的檢測(cè)技術(shù)操作繁瑣耗時(shí)，不能滿足高通量快速檢測(cè)的要 求，而且其他免疫分析方法大多為非均相的反應(yīng)，需要多步孵育和洗滌步驟，耗時(shí)長(zhǎng)，操作 復(fù)雜。針對(duì)這些不足，本發(fā)明提供了一種均相的、快速的磺胺二甲基嘧啶熒光偏振免疫檢測(cè) 方法。方法只需要加樣，無(wú)需分離和洗滌操作，十分鐘內(nèi)就可獲得檢測(cè)結(jié)果。另外，本發(fā)明 所應(yīng)用的磺胺二甲基嘧啶卵黃抗體穩(wěn)定性強(qiáng)，產(chǎn)量大，動(dòng)物傷害??；克服了傳統(tǒng)單克隆抗體 和多克隆抗體制作成本高、不滿足動(dòng)物福利要求等的不足。
[0034] 本研究建立的基于卵黃抗體的磺胺二甲基嘧啶熒光偏振免疫檢測(cè)中，標(biāo)準(zhǔn)曲線的 靈敏度為25. 29ng/mL，檢測(cè)范圍為2. 49-257. 02ng/mL ;由于牛奶基質(zhì)稀釋了五倍，在牛奶 中的檢測(cè)限為7.4 μ g/L。該方法快速、簡(jiǎn)便高通量，而且能夠滿足磺胺二甲基嘧啶的殘留檢 測(cè)限量要求，非常適合牛奶中的磺胺二甲基嘧啶的檢測(cè)需求。
【附圖說(shuō)明】
[0035] 圖1為基于卵黃抗體的磺胺二甲基嘧啶熒光偏振免疫檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，但本發(fā)明并不局限于此。
[0037] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；下述實(shí)施例中所 用的試劑、生物材料等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0038] 下述實(shí)施例中所使用的卵黃抗體的制備方法如下：以磺胺二甲基嘧啶為免疫原對(duì) 蛋雞進(jìn)行皮下背部多點(diǎn)免疫，免疫劑量為〇. 3mL(免疫原的濃度為lmg/mL)，之后每次間隔 2-3周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量減半，免疫次數(shù)為七次。
[0039] 制備得到的卵黃抗體對(duì)磺胺二甲基嘧啶的效價(jià)變化情況為：前三次加強(qiáng)免疫后效 價(jià)顯著上升直至抗體效價(jià)為1:216, 一段時(shí)間之后稍有下降，但是第四次加強(qiáng)免疫之后效價(jià) 達(dá)到最高1:218,之后一直維持在該水平。在最后一次加強(qiáng)免疫之后，卵黃抗體的效價(jià)可以 維持較高水平達(dá)30周之久。
[0040] 實(shí)例1、磺胺二甲基嘧啶熒光標(biāo)記物SM2-GA-EDF的制備
[0041] 步驟1 :以異硫氰酸熒光素和乙二胺為原料，合成了異硫氰酸熒光素乙二胺 (Fluoresceinthiocarbamyl ethylenediamine，EDF)，具體合成方法為：取 60mg FITC 溶于 IOmL甲醇溶液中，然后加入100 μ L三乙胺混勻；逐滴加入到含有IOOmg乙二胺的50mL甲 醇溶液中，邊加邊振蕩，滴完后繼續(xù)振蕩Ih ;過(guò)濾上述混合溶液，并用IOmL甲醇沖洗附著于 濾紙上的桔黃色沉淀；將得到的沉淀避光干燥保存。
[0042] 步驟2 :半抗原SM2-GA的制備
[0043] 2. 8-3. 2mg的SM2溶于250uL氯仿中，加入L 3-1. 7mg戊二酸酐，室溫?cái)嚢?-10小 時(shí)，即可獲得半抗原SM2-GA,將所獲得反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，即可獲得SM 2-GA粉末。
[0044] 步驟3 :半抗原SM2-GA與EDF的偶聯(lián)
[0045] 稱取 2. 3mg (20 μ mol) NHS 和 4. Img (20 μ mol) EDC 溶解于 500 μ L N, N-二甲基甲酰 胺（DMF);加入之前合成的半抗原SM2-GA粉末10 μ mol與上述反應(yīng)液混合，室溫過(guò)夜反應(yīng)； 稱取3. 3 μ mol EDF加入到上述半抗原SM2-GA反應(yīng)液中，室溫振蕩2h ;取少量反應(yīng)物通過(guò) 薄層色譜法分離，展開(kāi)劑為二氯甲烷：甲醇：乙酸（79:20:1)，刮下Rf