一種基于聚電解質(zhì)多層膜基片電泳流動(dòng)型elisa方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，特別涉及聚電解質(zhì)多層膜（polyelectrolyte multilayers:PEMs)的制備，電泳驅(qū)動(dòng)下的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，自免疫方法被確立以來(lái)，免疫傳感器作為新興的生物傳感器，以其鑒定 物質(zhì)高度特異性、靈敏性和穩(wěn)定性受到青睞。ELISA是少量蛋白質(zhì)檢測(cè)和定量的試驗(yàn)方 法，廣泛的應(yīng)用于食品、工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。ELISA在常規(guī)的聚苯乙烯 基板（polystyrene :PS)基板上的靜態(tài)溫育反應(yīng)存在以下幾個(gè)問(wèn)題：（1)在PS上的第一 抗體容易變性，并且與抗原反應(yīng)的部位不容易裸露在基片表面；(2)封閉效果不佳，導(dǎo)致 抗原及第二抗體的非特異性吸附，影響了 ELISA系統(tǒng)的靈敏度；（3)在抗原抗體反應(yīng)過(guò) 程中，抗原需要長(zhǎng)時(shí)間的自由擴(kuò)散，長(zhǎng)時(shí)間的溫育反應(yīng)成為限速步驟，導(dǎo)致緩慢的結(jié)合速 度，影響了分析的靈敏度和動(dòng)態(tài)量程。雖然有很多通過(guò)納米材料制備來(lái)提高ELISA系統(tǒng) 靈敏度的研究，但其操作復(fù)雜及成本過(guò)高，導(dǎo)致難以實(shí)際應(yīng)用。另外，微細(xì)加工芯片牌組 器、微陣列芯片、微流體技術(shù)，卻由于其表面修飾技術(shù)的欠缺、操作的復(fù)雜性等弊端不能 廣泛的應(yīng)用于高靈敏度的臨床檢測(cè)。此外，通過(guò)外力提高抗原在第一抗體附近的局部濃 度，能夠提高靈敏度的同時(shí)，還能大大縮短反應(yīng)時(shí)間。Punyadeera[Lieshout, R. M. L. van ; Domburg, Τ· van ;Saalmink, Μ· ；Verbeek, R. ；ffimberger-Friedl, R. ；Diei jen-Visser, M. P. van ；Punyadeera, C. Anal. Chem. 2009, 81, 5165 - 5171], Bruening[Dai, J. ；Baker, G. L.； Bruening, M. L. Anal. Chem. 2009, 78, 135 - 140]等通過(guò)壓力方式將檢測(cè)樣品流動(dòng)并透過(guò)第 一抗體固定的多孔膜的同時(shí)進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)，有效地提高了檢測(cè)效率及靈敏度，但是 壓力式流動(dòng)系統(tǒng)對(duì)于混合樣品（血清、全血）的檢測(cè)沒(méi)有初步篩選過(guò)程，導(dǎo)致多孔膜容易堵 塞，限制了檢測(cè)效率與靈敏度的提高。針對(duì)以上ELISA系統(tǒng)的檢測(cè)弊端，因此，尋找一種可 以"快速-靈敏-簡(jiǎn)便"檢測(cè)ELISA系統(tǒng)顯得尤為重要。將高分子功能膜的化學(xué)修飾與電 泳技術(shù)有機(jī)融合在ELISA系統(tǒng)中，解決常規(guī)ELISA體系非特異性吸附高、反應(yīng)效率低、混合 樣品檢測(cè)困難等問(wèn)題，具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于解決ELISA系統(tǒng)中樣品檢測(cè)低效率問(wèn)題并進(jìn)一步解決低靈敏 度的問(wèn)題而提供一種電泳流動(dòng)型ELISA的方法，尤其提供一種聚電解質(zhì)多層膜基片電泳流 動(dòng)型ELISA的方法，以解決【背景技術(shù)】中存在的問(wèn)題。本發(fā)明所提供的聚電解質(zhì)多層膜基片 電泳流動(dòng)型ELISA方法中，正電性PEMs修飾多孔膜，大幅度提高封閉劑蛋白的吸附量，有效 抑制抗原和第二抗體的非特異性吸附。其次電泳技術(shù)作為ELISA體系中抗原流動(dòng)檢測(cè)的驅(qū) 動(dòng)方式，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。
[0004] 本發(fā)明所提供的電泳流動(dòng)型ELISA方法，所采用的技術(shù)方案是：
[0005] (1)將第一抗體吸附到多孔膜基片上；
[0006] (2)吸附第一抗體的多孔膜基片再進(jìn)行封閉劑蛋白吸附；
[0007] (3)電泳驅(qū)動(dòng)抗原-第一抗體反應(yīng)：將步驟（2)第一抗體和封閉劑蛋白吸附后的 多孔膜基片固定在電泳裝置中，電泳裝置中多孔膜基片一側(cè)注入抗原溶液（即電泳溶液）， 多孔膜基片另一側(cè)注入磷酸鹽緩沖溶液，若抗原分子為負(fù)電荷則抗原溶液側(cè)插入負(fù)電極， 另一側(cè)插入正電極，反之則反。電極加電壓，進(jìn)行抗原-第一抗體反應(yīng)。
[0008] (4)第二抗體-抗原反應(yīng)，對(duì)酶標(biāo)第二抗體進(jìn)行顯色定量：步驟（3)電泳驅(qū)動(dòng)抗 原-第一抗體反應(yīng)后，將電泳后的多孔膜基片放入到第二抗體溶液中，進(jìn)行反應(yīng)，然后清 洗，將所得多孔膜基片放入第二抗體標(biāo)識(shí)酶的底物溶液中，進(jìn)行顯色；通過(guò)檢測(cè)吸光度，進(jìn) 行抗原定量分析。
[0009] 優(yōu)選上述多孔膜基片步驟（1)多孔膜基片是醋酸纖維素多孔膜（CA)或聚電解質(zhì) 多層膜修飾的CA多孔膜，聚電解質(zhì)多層膜修飾的CA多孔膜是依次利用聚（二烯丙基二甲 基氯化銨）和聚苯乙烯硫酸鈉交叉層疊修飾的CA多孔膜，且修飾的最外層是聚（二烯丙基 二甲基氯化銨），得到正電性的TODA/PSS修飾CA，即PEMs-CA (優(yōu)選PEMs-CA中聚（二烯丙 基二甲基氯化銨）和聚苯乙烯硫酸鈉交叉層疊修飾7層），通過(guò)其表面電荷性提高第一抗體 與封閉劑（卵清蛋白〇valbumin :0VA)的吸附量，提高抗原與抗體反應(yīng)的密度（信號(hào)）、抑制 抗原和第二抗體的非特異性吸附（噪音），進(jìn)而大幅度提高靈敏性（信號(hào)與噪音比例）。
[0010] 進(jìn)一步優(yōu)選步驟（3)電泳驅(qū)動(dòng)抗原-第一抗體反應(yīng)的電泳電壓和電泳時(shí)間，電泳 的電壓大小決定蛋白質(zhì)的移動(dòng)速度；電泳時(shí)間的長(zhǎng)短影響抗原和第一抗體結(jié)合的效率及自 組裝膜的穩(wěn)定性。調(diào)節(jié)電泳的電壓與時(shí)間，提高檢測(cè)靈敏度。上述多孔膜基片可以選取醋 酸纖維素 （cellulose acetate, CA)多孔膜作為檢測(cè)溶液透過(guò)基片；PDDA/PSS修飾的醋酸 纖維素膜為PEMs-CA。
[0011] CA與PEMs-CA電泳電壓與時(shí)間優(yōu)化范圍均為15-25V和2-8min，進(jìn)一步優(yōu)選CA電 泳電壓與時(shí)間為15v、2min ;PEMs-CA電泳電壓與時(shí)間為25v、2min。
[0012] 在此電泳流動(dòng)型ELISA系統(tǒng)中，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)第二抗體濃度進(jìn)行最優(yōu)化，確定 CA和PEMs-CA的第二抗體的最佳濃度分別為0. 5,1 μ g/mL。利用此第二抗體濃度檢測(cè)抗原 的定量曲線，得到PEMs-CA的檢測(cè)極限濃度為5ng/mL。達(dá)到傳統(tǒng)ELISA檢測(cè)水平的同時(shí)，檢 測(cè)速度提高了 30倍。
[0013] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0014] 1)本發(fā)明所提供的聚電解質(zhì)多層膜基片電泳流動(dòng)型ELISA方法，創(chuàng)制電泳環(huán)境中 能夠高效抑制ELISA非特異性吸附的PEMs。
[0015] 2)本發(fā)明所提供的聚電解質(zhì)多層膜基片電泳流動(dòng)型ELISA方法，創(chuàng)制靈敏、快速、 簡(jiǎn)便的電泳流動(dòng)型ELISA系統(tǒng)。電泳驅(qū)動(dòng)型流動(dòng)有效控制等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)向相反電性 的電極方向流動(dòng)，通過(guò)多孔膜，所以在短時(shí)間的流動(dòng)過(guò)程中使抗原局部濃縮到多孔膜（即 第一抗體）近旁，在少干擾環(huán)境中完成靈敏、快速的抗體-抗原反應(yīng)，與傳統(tǒng)ELISA相比大 幅度縮短了反應(yīng)時(shí)間。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1本發(fā)明實(shí)施例所用電泳裝置示意圖。
[0017] 圖2實(shí)施例1與2的電泳流動(dòng)型ELISA檢測(cè)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。本發(fā)明 實(shí)施例采用的電泳裝置見(jiàn)圖1。電泳裝置為一平放發(fā)的圓桶結(jié)構(gòu)，多孔膜位于中間將圓桶一 分為二，多孔膜的一側(cè)為抗原溶液，端面設(shè)有溶液進(jìn)口和電極；另一側(cè)為PB緩沖液，端面設(shè) 有溶液進(jìn)口和電極。
[0019] 實(shí)施例1
[0020] CA多孔膜基片電泳ELISA
[0021] 1)溶液的配置：
[0022] a)50mM Tris-HClOO. 15M NaCl 溶液的配置：將 I. 15175g Tris-base 固體溶于 125mL超純水中，取0. 84mL HCl溶于IOOmL超純水中得0.1 MHCl溶液，待溶解后將HCl溶 液滴加入Tris-base溶液中調(diào)pH = 7. 4為止，定容至250mL，稱(chēng)量2. 208g NaCl固體加入 Tris-HCl 中。