羊布魯氏菌膠體金抗體檢測試紙條的制作方法
【專利說明】羊布魯氏菌膠體金抗體檢測試紙條
[0001] 技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種羊布魯氏菌膠體金抗體檢測試紙條，屬生物制品檢測 技術(shù)領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 布魯氏菌病（布?。┦怯刹剪斒暇蚍Q布魯氏菌（Brucella)引起的以流產(chǎn)和發(fā) 熱為特征的人獸共患病，嚴(yán)重地威脅著人和多種動物的生命健康。本病不但對動物的繁殖 和生產(chǎn)性能具有嚴(yán)重危害，更重要的是，人感染布魯氏菌后，往往難以治愈，從而造成嚴(yán)重 的公共衛(wèi)生問題。因此在布魯氏菌流行的國家，消除布病一直是公共衛(wèi)生計劃中最重要的 目標(biāo)之一。
[0003] 布病在世界存在已有久遠(yuǎn)的歷史，人類對該病的研究認(rèn)識逐步加深，診斷水平不 斷提高，隨著動物布病的研究進(jìn)展，動物布病血清學(xué)的檢測方法不斷改進(jìn)和提高。傳統(tǒng)的凝 集試驗（如：虎紅抗原平板凝集試驗、試管抗原凝集試驗、乳環(huán)凝集試驗）逐漸被敏感性高、 特異性強(qiáng)的ELISA方法、熒光偏振試驗（FPA)等新的檢測技術(shù)所取代。
[0004] 凝集試驗是布魯氏菌病診斷的一種常用的方法，包括血清凝集實(shí)驗、乳環(huán)沉淀試 驗和抗人免疫球蛋白試驗，其中經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)試管凝集試驗（STAT)、平板凝集試驗（PAT)，以 上方法在發(fā)達(dá)國家已經(jīng)基本停止使用，取而代之的是緩沖布魯氏菌抗原凝集試驗如虎紅平 板凝集試驗（RBPT)。虎紅平板凝集抗原是用抗原性良好的布魯氏菌菌株經(jīng)培養(yǎng)，滅活，離心 收集菌體后用虎紅染料染色后懸浮于乳酸緩沖液中制成，該方法靈敏度高，價格便宜，操作 方便，檢測快速，適于動物群體布魯氏菌病的普查。在國際貿(mào)易中是牛、羊、豬布魯氏菌病檢 測的指定試驗，在我國也用于人布魯氏菌病監(jiān)測的初篩。
[0005] 在布魯氏菌病血清學(xué)檢驗中一致認(rèn)為補(bǔ)體結(jié)合試驗（CFT)在特異性上優(yōu)于其他 方法，常被用來對試管凝集試驗和虎紅平板凝集試驗檢測為陽性或可疑的病例進(jìn)行定性檢 測。補(bǔ)體結(jié)合試驗一直被認(rèn)為是最有效的布病診斷方法，至今尚沒有一種診斷方法能取代 補(bǔ)體結(jié)合試驗在血清學(xué)診斷中的地位。但補(bǔ)體結(jié)合試驗所需要的溶血素的制備困難，試驗 操作繁瑣，難以在臨床上普遍使用，而且由于豬體內(nèi)的補(bǔ)體會干擾豚鼠補(bǔ)體的作用，導(dǎo)致敏 感性下降。
[0006] ELISA是一種與CFT效果相當(dāng)?shù)脑\斷方法，該方法操作方便，靈敏度高，特異性較 好，一次可以完成大量樣品的檢測，既可以作為篩選試驗應(yīng)用于動物群體檢疫，還可以作為 確診試驗。ELISA不僅可以應(yīng)用于血清抗體的檢測，還可應(yīng)用于乳樣中抗體的檢測。牛的布 魯氏菌病ELISA檢測方法已是國際貿(mào)易中指定的檢測方法之一，其他種布魯氏菌的ELISA 檢測方法也是研究的熱點(diǎn)，但目前還沒有商品化的羊布魯氏菌間接ELSIA試劑盒。
[0007] 上述各種布病檢測方法各有其自身的特點(diǎn)，但存在的共同缺陷是以上各種檢驗都 必須在實(shí)驗室內(nèi)完成。一般先分離血清，然后按照各種方法的操作程序進(jìn)行實(shí)驗室檢驗。而 免疫膠體金技術(shù)克服了上述缺陷，可以直接采血后，滴加到膠體金試紙條加樣孔內(nèi)，現(xiàn)場就 能判定是否為布魯氏菌感染。
[0008] 雖然已有相關(guān)膠體金發(fā)明專利的報道，如中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸 醫(yī)研究所王興龍等、吉林大學(xué)閆廣謀等（【申請?zhí)枴緾N200710055740. 5, CN200710055741.X， CN200810051726. 2)采用以重組的金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA)作為金標(biāo)抗體，由于SPA具 有非特異性吸附IgG分子的能力，因此可用于對多種不同動物進(jìn)行診斷，但對不同動物體 內(nèi)IgG吸附能力各不相同，因此對采用同一個試紙條對不同動物進(jìn)行布病檢測，其敏感性 并不穩(wěn)定。再如，杭州迪恩科技有限公司張明洲等（【申請?zhí)枴緾N201310033074. 0)，采用布 魯氏菌菌體抗原作為質(zhì)控線包被抗原，再利用一種抗紅細(xì)胞的單克隆抗體作為競爭用的單 抗，吸附干燥的膠體金蛋白（流動帶），建立了夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡。 但目前尚未有專門針對羊布病檢測的膠體金試紙條。而羊在我國飼養(yǎng)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于牛的飼養(yǎng) 量，大約是?？偞鏅诹康?倍，當(dāng)前我國布病的嚴(yán)峻防控形勢與羊群較高的感染率是分不 開的。因此開發(fā)適合基層使用的羊布病膠體金檢測試紙條尤其必然的現(xiàn)實(shí)意義。
[0009] 本發(fā)明以制備的光滑型布魯氏菌S2株的脂多糖（LPS)作為測試線包被抗原（檢 測帶），以鼠抗羊IgG Fc端的單克隆抗體標(biāo)記膠體金制成膠體金抗體檢測試紙條的金膠墊 (流動帶），以兔抗鼠 IgG抗體作為檢測試紙條的質(zhì)控抗原（質(zhì)控帶），建立了羊布魯氏菌膠 體金抗體檢測試紙條，研究表明本發(fā)明開發(fā)的試紙條具有良好的特異性、敏感性和穩(wěn)定性。 [0010] 本發(fā)明專利具有操作簡單，結(jié)果快捷，易于判斷和保存等優(yōu)點(diǎn)，同時無需任何儀器 設(shè)備，非常適合臨床快速診斷，特別是基層農(nóng)村和小規(guī)模養(yǎng)殖場的布病檢測。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于改變現(xiàn)有羊布魯氏菌診斷技術(shù)均需要依靠實(shí)驗室的現(xiàn)狀，為我 國羊布魯氏菌的診斷提供一種方便快捷，并具有良好特異性和敏感性的診斷方法。
[0012] 本發(fā)明技術(shù)方案
[0013] 1. -種羊布魯氏菌膠體金抗體檢測試紙條，該試劑條主要含有：以制備的光滑型 布魯氏菌S2株的脂多糖（LPS)作為測試線包被抗原（檢測帶），以鼠抗牛IgG Fc端的單克 隆抗體標(biāo)記膠體金制成膠體金抗體檢測試紙條的金膠墊（流動帶），以羊抗鼠 IgG抗體作為 檢測試紙條的質(zhì)控抗原（質(zhì)控帶），同時含有試紙條樣品吸收墊（樣品墊）、玻璃纖維素膜 (膠體金墊）、吸水紙。將噴有檢測線、質(zhì)控線的硝酸纖維素膜上端貼上吸水墊，下端貼上 金標(biāo)墊及樣品吸收墊，以上各組分首尾相連，完整銜接，其中：
[0014] (1)該試紙條中使用的包被抗原LPS來源于豬種布魯氏菌（S2株），該LPS對豬、 牛、羊布魯氏菌病的病原菌具有良好的敏感性，提高了試劑盒檢測的敏感性；
[0015] (2)LPS提取過程中增加了蛋白酶K消化和苯酚抽提步驟，提高了 LPS純度，減少 了 LPS中陰雜蛋白含量過高導(dǎo)致的非特異性反應(yīng)；本試劑盒不僅能有效排除常規(guī)革蘭氏陰 性細(xì)菌對布魯氏菌的干擾，而且能排除一般布病間接ELISA試劑盒無法區(qū)分小腸結(jié)腸炎耶 爾森氏菌09和大腸桿菌0157干擾的技術(shù)缺陷，提高了檢測的特異性；
[0016] (3) LPS的包被量基于對其純度和質(zhì)量的測定；
[0017] (4)本發(fā)明利用鼠抗羊IgG Fc端的單克隆抗體標(biāo)記膠體金制成膠體金抗體檢測 試紙條的金膠墊，進(jìn)一步提高了檢測的特異性。
[0018] 2.羊布魯氏菌膠體金抗體檢測試紙條中的LPS抗原的純度測定方法采用的是：
[0019] 將商品化 LPS 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成 lmg/ml、100 μ g/ml、10 μ g/ml、1 μ g/ml、100ng/ml、 lOng/ml等不同稀釋度；同時根據(jù)稱重結(jié)果將LPS配制成lmg/ml的初始濃度，并稀釋成 100 μ g/ml的濃度。將上述各稀釋度的LPS溶液取100 μ 1/樣品加入96孔酶標(biāo)板上，在 529nm波長下讀取吸光度。建立LPS標(biāo)準(zhǔn)品各稀釋度的OD529值，并建立濃度與吸光度之間 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及布魯氏菌LPS吸光度，計算LPS的濃度。LPS純度為：LPS 濃度X單位體積/單位質(zhì)量。
[0020] 3.羊布魯氏菌膠體金試紙條的應(yīng)用時對布魯氏菌檢測不需要復(fù)雜的檢測儀器，能 在采血現(xiàn)場進(jìn)行檢測，特別適合羊場養(yǎng)殖人員和基層獸醫(yī)使用。
[0021] 本發(fā)明【具體實(shí)施方式】
[0022] 本發(fā)明主要包含以下三個方面的內(nèi)容：
[0023] L檢測抗原的制備
[0024] 選取豬種布魯氏菌（Brucella suis)疫苗株S2株作為抗原生產(chǎn)種子，將S2經(jīng)TSA 培養(yǎng)后，提取的LPS，經(jīng)純化和定量后，用于固定于膠體金試紙條的硝酸纖維素膜對應(yīng)檢測 線的位置。
[0025] (1)本申請建立了 LPS抗原制備用布魯氏菌S2株（B. sius S2)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
[0026] 1)菌落形態(tài)菌落邊緣整齊、圓潤，露滴狀，斜光照射，逆光觀察微帶藍(lán)色乳光。
[0027] 2)染色形態(tài)為球桿菌，單個散在，不形成芽孢和莢膜。大小在0. 3~0. 6 μ m之 間。革蘭氏染色為陰性，柯氏染色為紅色。
[0028] 3)純粹按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)純粹。
[0029] 4)特異性
[0030] ①血清學(xué)特異性以培養(yǎng)物制成抗原，與光滑型布魯氏菌陽性血清應(yīng)出現(xiàn)凝集，與 粗糙型血清不出現(xiàn)凝集。
[0031] ②PCR特異性合成如下4條引物，將其配成引物混合儲存液，各引物濃度均為 25 μ M0
[0032] Feri :5' -GCGCCGCGAAGAACTTATCAA-3'（序列 1)
[0033] Reri:5'-CGCCATGTTAGCGGCGGTGA-3'（序列 2)
[0034] FSU1S:5'-GCGCGGTTTTCTGAAGGTTCAGG-3'（序列 3)
[0035] Ris711:5 ' -TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3 '（序列 4)
[0036] 模板：S2菌落或提取的S2基因組DNA。
[0037] ③PCR 反應(yīng)體系：50yL 的反應(yīng)體系中，含 5yL 10XBuffer，8yL2. 5mMdNTPs，混 合引物儲存液2 μ L，Taq酶2U，模板DNA 1 μ L (或蘸取少許菌落）。
[0038] ④ PCR 反應(yīng)程序：95°C 5min 后，按 94°C lmin、60°C I. 5min、72°C I. 5min 進(jìn)行 28 個 循環(huán)，最后72°C lOmin。
[0039] ⑤結(jié)果：擴(kuò)增產(chǎn)物用I. 5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定，應(yīng)出現(xiàn)2條特異性PCR條 帶，大小分別為178bp和285bp (見附圖1)。
[0040] (2)本申請建立了 S