Ck19聯(lián)合ov6在制備肝癌分子分型試劑盒及肝癌個體化治療中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及CK19和0V6蛋白的聯(lián)合應(yīng)用，具體涉及CK19和0V6蛋白組合在制備肝癌分子分型試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明中的CK19和0V6蛋白及相應(yīng)的試劑盒可以用于判定肝前體細(xì)胞來源的肝癌(即CK19+0V6+的肝癌)，并可以用于評估此類肝癌病人預(yù)后和指導(dǎo)Dasatinib對此類病人進(jìn)行個性化治療。
【背景技術(shù)】
[0002]原發(fā)性肝癌是全球第六大常見腫瘤，其病死率位居世界第二位。原發(fā)性肝癌按照細(xì)胞來源主要分為三種類型:肝細(xì)胞癌(HCC)、肝內(nèi)膽管癌(ICC)及混合型肝癌(CHC)。其中HCC是最常見的肝癌類型，約占78% (參見文獻(xiàn)Ferlay J, et al.Cancer incidenceand mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GL0B0CAN 2012.1nternat1nal Journal of Cancer2015 ; 136:E359-E386.Laursen L.)。雖然 HCC 主要起源于肝細(xì)胞，但HCC的高度異質(zhì)性以及部分HCC表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物支持部分HCC來源于肝前體細(xì)胞的假設(shè)(參見文南犬 Roskams T.Liver stem cells and their implicat1n inhepatocellular and cholang1carcinoma.0ncogene 2006 ；25:3818-3822.) 0 已知約十分之一的HCC表達(dá)膽管細(xì)胞標(biāo)志物CK19，CK19的表達(dá)與肝癌病人預(yù)后不良相關(guān)，而且CK19陽性肝癌細(xì)胞對常規(guī)化療藥和sorafenib不敏感。研究發(fā)現(xiàn)CK19+HCC中肝前體細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)明顯高于 CK19 HCC (參見文獻(xiàn) Govaere O, Komuta M, Berkers J, et al.Keratin19:a key role player in the invas1n of human hepatocellular carcinomas.Gut2013: gut jnl-2012-304351.)，提示惡性轉(zhuǎn)化的肝前體細(xì)胞可能是CK19+HCC的來源之一。惡性轉(zhuǎn)化的肝前體細(xì)胞與肝癌干細(xì)胞極度類似，與肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和化療抵抗密切相關(guān)。當(dāng)然CK19+HCC之所以表達(dá)CK19也可能是由于肝細(xì)胞去分化表達(dá)了膽系的標(biāo)志物造成的，這種來源的CK19+HCC在病人中也較常見。但是，目前臨床上尚沒有方法可以鑒別由肝前體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而來的肝癌和由肝細(xì)胞去分化表達(dá)膽系標(biāo)志物如CK19的肝癌，我們認(rèn)為鑒定肝前體細(xì)胞來源的HCC將有助于優(yōu)化HCC的分子分型及肝癌病人的預(yù)后評估和個性化治療。
[0003]肝前體細(xì)胞主要位于肝臟赫令氏管，具有分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的雙向分化潛能，有研究報(bào)道肝前體細(xì)胞表達(dá)某些特異的標(biāo)志物如0V6 (參見文獻(xiàn)Crosby HA, HubscherSG, Joplin RE, et al.1mmunolocalizat1n of 0V-6, a putative progenitor cell markerin human fetal and diseased pediatric liver.Hepatology 1998;28:980-985.)。當(dāng)肝臟發(fā)生病毒性肝炎、酒精性肝炎、肝硬化等慢性損傷時，肝細(xì)胞的增殖被抑制，則肝前體細(xì)胞會代償性擴(kuò)增，其擴(kuò)增程度與疾病程度呈正相關(guān)(參見文獻(xiàn)Libbrecht L, etal.Deep intralobular extens1n of human hepatic ^progenitor cells’ correlateswith parenchymal inflammat1n in chronic viral hepatitis: can ^progenitorcells，migrate ? The Journal of pathology 2000;192:373-378.)。本發(fā)明人所在生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，HBx的整合或細(xì)胞因子TNF-α、TGF-β的長期刺激均能導(dǎo)致肝前體細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，參與肝炎、肝硬化引起的肝癌發(fā)生(參見文獻(xiàn)心K, etal.Hepatic transforming growth factor beta gives rise to tumor-1nitiating cellsand promotes liver cancer development.Hepatology 2012 ;56:2255-2267.)。而且本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)0V6陽性的肝癌細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特征如化療抵抗等。以上結(jié)果提示肝前體細(xì)胞可以作為肝癌的細(xì)胞來源，區(qū)分肝前體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化來源的肝癌并發(fā)現(xiàn)其關(guān)鍵調(diào)控因子有助于這部分肝癌的預(yù)后判定和個體化治療。
[0004]目前CK19和0V6聯(lián)合作為肝癌分子分型標(biāo)志物并指導(dǎo)預(yù)后和個性化治療未見文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個目的是提供CK19和0V6蛋白的聯(lián)合應(yīng)用，特別是在制備肝癌分子分型試劑盒中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的另一個目的是提供一個基于CK19和0V6的肝癌分子分型試劑盒，及該試劑盒在肝前體細(xì)胞來源的肝癌類型判定、預(yù)后評估及治療指導(dǎo)中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明前期統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人所在的中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院手術(shù)切除的HCC中膽系標(biāo)志物CK19陽性比例約為9%。由于肝前體細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的標(biāo)志物，因此其可能是CK19+HCC的主要來源。0V6是公認(rèn)且常用的肝前體細(xì)胞標(biāo)志物，通過對CK19+HCC進(jìn)行0V6免疫組織化學(xué)染色，我們發(fā)現(xiàn)其中約65%呈0V6陽性，說明這部分CK19+0V6+HCC來源于肝前體細(xì)胞，提示CK19和0V6的聯(lián)合應(yīng)用可指導(dǎo)肝癌的分子分型。
[0008]進(jìn)一步地，本發(fā)明對CK19+0V6+HCC和CK19+0V6 HCC病人的臨床病理特征和預(yù)后進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CK19+0V6+HCC具有更侵襲性的病理特征，且病人預(yù)后更差，提示CK19和0V6的聯(lián)合應(yīng)用可以用于肝癌的預(yù)后評估。
[0009]更進(jìn)一步地，本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化的肝前體細(xì)胞中src活性顯著增強(qiáng)，是細(xì)胞中重要的調(diào)控因子；使用src抑制劑Dasatinib能顯著抑制其自我更新能力，提示Dasatinib可能用于肝前體細(xì)胞來源的CK19+0V6+HCC的個性化治療。由于Dasatinib已經(jīng)處于治療胃腸間質(zhì)腫瘤的II期臨床試驗(yàn)，使得我們的發(fā)現(xiàn)能較好地轉(zhuǎn)化至臨床。
[0010]因此，本發(fā)明認(rèn)為，CK19和0V6的聯(lián)合應(yīng)用具備作為肝癌分子分型標(biāo)志物的可能性，并可指導(dǎo)肝癌預(yù)后和個性化治療。
[0011]本發(fā)明的第一方面，提供了 CK19和0V6聯(lián)用在制備肝癌分子分型標(biāo)志物中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明的第二方面，提供了 CK19和0V6聯(lián)用在制備肝癌分子分型試劑盒中的應(yīng)用。
[0013]所述的肝癌分子分型試劑盒，鑒別CK19+0V6+HCC和CK19+0V6 HCC0
[0014]所述的試劑盒，是通過免疫組織化學(xué)方法檢測生物樣品中CK19和0V6的表達(dá)情況。
[0015]所述的試劑盒，包括:特異性識別人CK19的抗體、特異性識別人0V6的抗體、免疫組化實(shí)驗(yàn)試劑等。
[0016]所述的生物樣品，為病人肝癌的石蠟包埋組織。
[0017]本發(fā)明的第三方面，提供了上述用于檢測肝癌組織中CK19和0V6試劑盒的檢測方法，具體步驟如下:
[0018]1.脫蠟至水
[0019](I) 4 μ m厚石蠟切片，每個腫瘤組織2張連續(xù)切片，60°C烤箱烤Ih ;
[0020](2) 二甲苯 1min x 3 次；
[0021](3)依次經(jīng)過100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、雙蒸水，各5min。
[0022]2.抗原修復(fù)
[0023](1)3% H2O2甲醇液 20min ；
[0024](2)雙蒸水洗 5minx 3 次；
[0025](3)抗原修復(fù)(高壓修復(fù)):
[0026]切片放入盛有EDTA堿性修復(fù)液(2mM EDTA、2mM Na2HPO4)的高壓鍋中，高壓煮沸2min，自然冷卻至室溫。
[0027]3.一抗孵育
[0028](I)PBS 洗 5min;
[0029](2) 50 μ I 1% BSA 覆蓋組織，37°C 封閉 30min ；
[0030](3)吸去封閉液，2張連續(xù)切片分別滴加CK19、0V6 一抗50 μ 1，濕盒中4°C孵育過夜。
[0031]4.二抗孵育
[0032](I)吸走一抗，PBS 洗 5minx 4 次；
[0033](2)滴加 50 μ I 帶 HRP 標(biāo)記的二抗，37°C孵育 30_45min ；
[0034]5.顯色、反藍(lán)
[0035](I) PBS 洗 5minx 4 次；
[0036](2) DAB (1:50)顯色3_10min，至出現(xiàn)磚紅色沉淀，雙蒸水終止顯色；
[0037](3)蘇木素復(fù)染lOmin，鹽酸酒精分化后自來水沖洗反藍(lán)20_30min。
[0038]6.脫水封片
[0039](I)依次經(jīng)過雙蒸水、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、石炭酸、二甲苯，各5min。滴加樹脂封片。
[0040]7.分析
[0041]顯微鏡下判讀CK19和0V6的表達(dá)是否為陽性。
[0042]本發(fā)明的第四方面，提供了上述檢測肝癌組織中CK19和0V6表達(dá)的試劑盒在制備肝癌分子分型試劑盒中的應(yīng)用。
[0043]本發(fā)明提供了一種肝癌分子分型試劑盒，用于鑒別CK19+0V6+HCC和CK19+0V6 HCC0
[0044]所述的試劑盒通過免疫組織化學(xué)方法檢測生物樣品中CK19和0V6的表達(dá)情況。
[0045]所述的試劑盒，包括:特異性識別人CK19的抗體、特異性識別人0V6的抗體、免疫組化實(shí)驗(yàn)試劑等。
[0046]所述的生物樣品，為病人肝癌的石蠟包埋組織。
[0047]所述的肝癌，為原發(fā)性肝細(xì)胞癌。