用于純化核酸的方法和試劑盒的制作方法【專利說明】[0001]本申請要求在2012年8月28日提交的美國臨時申請No.61/693,963和在2012年9月5日提交的美國臨時申請No.61/697,116的優(yōu)先權(quán)。
技術(shù)領域：
[0002]本發(fā)明主要涉及用于分離和/或純化核酸的方法，特別是涉及使用固體單塊過濾器從樣品分離和/或純化核酸的方法，所述固體單塊過濾器易于自動化?！?br>背景技術(shù)：
】[0003]核酸純化對于大多數(shù)只是進行分子診斷和研究使用的用途是需要的，包括非侵入性產(chǎn)前診斷（NIPD)的胎兒DNA的純化。提取過程已經(jīng)通過利用基于磁珠和膜的形式進行流水線化和自動化。雖然有效，但是當面對具有挑戰(zhàn)性的臨床基質(zhì)（clinicalmatrice)時，顆粒和膜具有已知的局限性。例如，基于膜和珠子的柱子具有依從性，具有小的孔隙尺寸，并且需要某一類型的支持物以受到離心機或者真空系統(tǒng)的處理。膜和珠子柱的物理特性導致顯著的流體阻力，這限制了能夠有效地受到處理而沒有堵塞耗材的樣品類型和/或能夠通過流動路徑單向處理的總（輸入）樣品體積。相反，磁性顆粒必須通過攪拌而遍布樣品分布。需要在溶液內(nèi)均一地分布磁性顆粒限制了能夠采用大多數(shù)磁珠耗材進行處理的總輸入樣品體積。臨床樣品屬性（例如粘性或者復雜度）可能導致在管子或者棒材的側(cè)部上的沒有效率的磁性顆粒濃度。并且硅粉能夠在提取過程中使珠子破碎，從而失去它們的磁性并且污染最終的樣品。[0004]對用于篩查和診斷兩種目的的分子測試存在高的需要提高了實驗室中的樣品生產(chǎn)能力的要求。從提取一直到檢測的處理步驟的自動化對于減輕這些樣品處理負擔是至關(guān)重要的。上述提及的其他提取技術(shù)存在固有限制，對于適應于自動化的簡單且低價格的核酸純化系統(tǒng)仍然存在需要?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0005]本申請的一個方面涉及一種用于從液體樣品中純化核酸的自動化方法，所述方法包括：(a)向機器人平臺加載多個移液器吸頭，每個吸頭包括限定位于第一開口和第二開口之間的通路的殼體和占據(jù)所述通路的一部分的過濾器，其中，所述過濾器特異性地結(jié)合核酸，并且其中所述自動化機器人平臺能夠自動地分配試劑、取出樣品內(nèi)容物，并且移動移液器吸頭和/或樣品管；(b)使包含核酸的液體樣品的至少一部分經(jīng)移液器吸頭的所述第一開口流動進入，使得所述核酸通過所述移液器吸頭并且結(jié)合至其中的所述過濾器；（C)經(jīng)由所述第一開口將所述部分的液體樣品從所述移液器吸頭排出，其中所述部分的液體樣品在離開所述移液器吸頭的同時第二次通過所述過濾器；以及（d)通過使洗脫緩沖液經(jīng)所述移液器吸頭的所述第一開口流動進入并且經(jīng)由所述第一開口從所述移液器吸頭排出所述洗脫緩沖液來將所述核酸從所述過濾器洗脫，其中，所述洗脫緩沖液在進入和離開所述移液器吸頭的同時通過所述過濾器。[0006]本申請的另一個方面涉及一種用于將血漿樣品中的胎兒核酸與母系（maternal)核酸分開和分離的方法，所述方法包括：(a)使包含胎兒核酸和母系核酸的血漿樣品在允許所述胎兒核酸和母系核酸特異性地結(jié)合至第一過濾器的條件下流動通過所述第一過濾器；(b)將結(jié)合的胎兒核酸和母系核酸從所述第一過濾器中洗脫，從而形成包含胎兒核酸和母系核酸的經(jīng)濃縮的核酸樣品；（c)使所述經(jīng)濃縮的核酸樣品在允許所述母系核酸結(jié)合至第二過濾器并且所述胎兒核酸流動通過所述第二過濾器的條件下流動通過所述第二過濾器；和（d)從所述第二過濾器收集流動通過組分，其中，來自所述第二過濾器的所述流動通過組分含有胎兒核酸。[0007]本申請的另一個方面涉及一種用于將血漿樣品中的胎兒核酸與母系核酸分離的試劑盒，所述試劑盒包括：移液器吸頭，所述移液器吸頭包括自支持玻璃熔塊過濾器，其中所述玻璃熔塊過濾器具有2微米至220微米的孔隙尺寸，并且沒有使用改善核酸與所述玻璃熔塊過濾器的結(jié)合的試劑處理或者包被過；第一結(jié)合緩沖液，所述第一結(jié)合緩沖液被配制成準備與血漿樣品混合并且提供第一結(jié)合混合物，所述第一結(jié)合混合物具有約17體積％至25體積％的脂肪醇和濃度為約0.5M至約4.OM的離液序列高的鹽（chaotropicsalt);和第二結(jié)合緩沖液，所述第二結(jié)合緩沖液被配制成準備與血漿樣品混合并且提供第一結(jié)合混合物，所述第一結(jié)合混合物具有約〇體積％至10體積％的脂肪醇和濃度為約IM至約4.OM的離液序列高的鹽。[0008]當結(jié)合如下附圖閱讀下文的【具體實施方式】時將會清楚這些和其他方面和優(yōu)點。【附圖說明】[0009]圖IA至ID是根據(jù)本申請的移液器吸頭裝置的各種實施方式的示意圖，所述移液器吸頭包括空腔室和用于純化核酸的過濾器。[0010]圖2A至2D是根據(jù)本申請的用于純化胎兒核酸的例示性方法的示意性圖示。[0011]圖3不出了操作臺（Worktable)(B)上的艾本德（Eppendorf)epMotion5070樣品板布局圖（A)和試劑/消耗品的布置。所述樣品板可以被構(gòu)造成用于多達24個樣品（分別為第1、5和9列），不過印Motion將只是同時處理8個樣品。[0012]圖4示出了來自混合在鼻咽抽吸物（nasopharyngealaspirate，NPA)中的流感病毒的自動化提取的實時PCR結(jié)果。輸入NPA體積=100μL，洗脫體積=50μL。結(jié)果是來自每個洗脫水平和流感標靶5個不同NPA背景的3次重復提取（η=15)的平均值。qPCR是在LightCycler480系統(tǒng)上進行。[0013]圖5示出了用于從全血純化基因組DNA的漢密爾頓（Hamilton)STAR面板（deck)布局圖（不按比例）。面板位置I=漢密爾頓Iml過濾式吸頭；2=漢密爾頓Iml非過濾式吸頭；3=愛康尼（Akonni)/漢密爾頓ImlLPT2mm過濾器吸頭；4=輸入血液樣品載體(血液收集管或者微型離心管）；5-9=290ml試劑槽，它們分別用于裂解緩沖液F(LySisBufferF)、乙醇、洗滌緩沖液J、洗滌緩沖液K和洗脫緩沖液A2。10=96深孔結(jié)合板；11=96深孔洗滌J;12=96深孔洗滌K;13=96深孔洗脫板；14=漢密爾頓HHS2加熱器/搖動器，其具有Nunc96深孔溫育板；15=50ml試劑槽，其含有蛋白酶K。[0014]圖6A至6G顯示了各種基因組DNA(gDNA)提取的結(jié)果。圖6A顯示了來自NanoDrop1000(賽默飛世爾（ThermoFisher))的UV-可見痕跡，其來自于從全血提取的人類gDNA的10個隨機選擇重復。圖6B顯示了從全血提取的過濾器吸頭純化的人類gDNA的I%瓊脂糖凝膠。M=飛世爾24kbMaxDNALadder。泳道1-4=~IOOng來自四個隨見選擇重復的純化gDNA。圖6C顯示了從每輪收集200μL的8輪的gDNA收率的可重復性，全血輸入根據(jù)本發(fā)明進行處理。圖6D顯示了在來自ImlTrHI丨31;過濾器（左側(cè)）處理（各8輪）的100μ1、200μ1和300μ1的全血輸入體積和來自5mlTVuTipli過濾器（中間和右側(cè)）的1000μ1和2000μ1全血體積的范圍，來自全血的平均gDNA收率呈線性。圖6E顯示了其中對48個400μ1樣品（24個唾液和24個空白）進行qPCR分析的交叉污染研究的結(jié)果。圖6F顯示了來自使用凱杰（Qiagen)手動旋轉(zhuǎn)柱方法（Qiagen'smanualspincolumnmethod)(右側(cè)柱/對）和根據(jù)本發(fā)明的自動化提取方法（左側(cè)柱/對）提取的7個獨立的盲選唾液樣品（樣品A-G;400μ1輸入/100μ1洗脫）的平均gDNA收率的比較的UV(紫外線）吸光度結(jié)果。圖6G顯示了ΤΓ??Πρ?過濾器處理的200μ1全血（柱1)與五個其他競爭物提取系統(tǒng)（柱2至6)相比的處理時間。[0015]圖7是顯示了根據(jù)本發(fā)明的用于純化胎兒核酸的方法的一個實施方式的流程圖。[0016]圖8Α是瓊脂糖凝膠的圖，其顯示了通過超聲處理進行片段化以模擬在實際母系樣品中所見到的長度的女性和男性基因組DNA(女性=母系DNA，男性=胎兒DNA)。圖8Β是顯示了在不同稀釋度的胎兒DNA的回收的圖。實時PCR結(jié)果來自分別針對TruTip(實心棱形和實心矩形）和凱杰（空心三角形和X)的每個樣品含有100至Ing的片段化男性DNA和包括200ng片段化女性DNA的總DNA的提取樣品，η=3提取，每次提取η=3/用于PCR的樣品。誤差線指示土一個標準誤差。[0017]圖9是顯不了米用或者不米用本申請的富集步驟的胎兒DNA(ChromΥ)和總DNA(Chrom1)回收。母系血清有四個重復，每個5ml。CHY量化男性胎兒DNA，而CHl量化所存在的總DNA(胎兒的和母系的）。qPCR在采用先前公開的測試靶向CHY和CHl的LightCycler480系統(tǒng)上進行。[0018]圖10示出了用于從大體積血清樣品純化DNA的漢密爾頓STARplus面板布局圖(不按比例）。該系統(tǒng)裝配有8X5ml通道和8XIml通道。面板位置1=漢密爾頓4ml過濾式吸頭；2=愛康尼/漢密爾頓5ml過濾器吸頭；3=來源血清樣品；4=50ml錐形管；5=120ml試劑槽，其裝有CN-W1、CN-W2和CN-W4試劑；6=小體積試劑槽，其裝有蛋白酶K、CN-B2、CN-B3、EBA2、EBB和CN-W3試劑；7=290ml試劑槽，其裝有CN-Ll試劑；8=290ml試劑槽，其裝有CN-Bl試劑；9=96深孔板，其用于步驟1;10=96深孔板，其用于步驟2;11=樣品載體，其用于經(jīng)純化的最終產(chǎn)物；12=漢密爾頓Iml非過濾式吸頭；13=愛康尼/漢密爾頓ImlLPT4mm過濾器吸頭。[0019]圖IIA示出了來自使用大體積過濾器吸頭程序處理的合并母系血清樣品的8個重復樣品的qPCR結(jié)果。全部程序（包括離線蛋白酶K預處理）在約2小時內(nèi)完成。胎兒男性（CHY)和總（CHl)DNA的所有重復的平均Ct值分別為34.58±0.66和29.76±0.50,這展示了自動化提取方法的優(yōu)異的可重復性?？侱NA池（為基因組等分試樣）中的胎兒DNA的濃度根據(jù)與標準物比較的擬合點分析進行計算，所有樣品的所得平均胎兒DNA%為2.8%。這個樣品的胎兒DNA的真實％是未知的，因為這些樣品在進行提取之前合并。圖IlB顯示了從根據(jù)上述提取程序使用采用愛康尼TmTipk5過濾器的自動化系統(tǒng)（左側(cè)柱/對）和凱杰手動循環(huán)核酸試劑盒（Qiagen'smanualCirculatingNucleicAcidKit)(右側(cè)柱/對）從11個獨特的重復母系血清樣品回收的胎兒DNA的百分比的比較。【具體實施方式】[0020]本申請?zhí)峁┝擞糜趶臏y試樣品中純化核酸的方法和裝置。具體地說，本申請?zhí)峁┝艘环N簡單的核酸提取技術(shù)，由此將單塊核酸結(jié)合基質(zhì)（matrix)插入到移液器吸頭或類似的裝置中。核酸提取使用樣品制備形式進行，該樣品制備形式與大多數(shù)操作儀器相容并且因此適合于自動化和適用于很多培養(yǎng)基到高通量臨床應用和樣品基質(zhì)。在一些實施方式中，本申請涉及一種使用帶有多個移液器吸頭的機器人平臺從液體樣品純化核酸的自動化方法。[0021]本申請進一步提供了適合于從具有較高的分子量（HMff)DNA(例如母系DNA)的背景中優(yōu)先選擇低分子量（LMff)DNA片段（例如胎兒DNA)的方法。所述方法增加了樣品中存在的LMffDNA的百分比，而不管所存在的HMWDNA的量如何，并且提供了處理大樣品體積例如多達20ml的大體積的能力，以符合某些臨床應用的靈敏性要求。在一些實施方式中，本申請涉及一種用于使用一種或者多種過濾器將血漿樣品中的胎兒核酸與母系核酸分開和分離的方法，所述一種或者多種過濾器允許所述胎兒核酸和/或母系核酸與所述一種或者多種過濾器特異性地結(jié)合。本申請還提供了用于將血漿樣品中的胎兒核酸與母系核酸分離的試劑盒。[0022]本文使用的術(shù)語"測試樣品"或者"樣品"是指可能包含核酸的任何材料。測試樣品的示例包括但不限于生物樣品、環(huán)境樣品和非天然樣品。生物樣品的示例包括但不限于組織樣品、生物流體樣品、細胞樣品、細菌樣品和病毒樣品。組織樣品包括從任何動物或植物分離的組織。生物流體樣品包括但不限于血液、血漿、尿液、唾液、痰液、腦脊液、鼻咽分泌物、空腔分泌物、灌洗液（如支氣管的）和白細胞提取樣品。細胞樣品包括但不限于培養(yǎng)的細胞或從任何來源分離的細胞。病毒樣品包括但不限于培養(yǎng)的病毒或分離的病毒。環(huán)境樣品包括但不限于空氣樣品、水樣品、土樣品、巖石樣品和從自然環(huán)境中獲得的任何其他樣品。人工樣品包括在自然環(huán)境中不存在的任何樣品。"人工樣品"的例子包括但不限于純化或分離的材料、培養(yǎng)的材料、合成的材料和任何其他人造材料。在一些實施方式中，測試樣品包括痰液、NALC處理痰液、全血或血液培養(yǎng)物、血漿、腦脊液、鼻咽擦拭物和抽吸物、支氣管灌洗液、新鮮的或冷凍的細胞和組織、FFPE樣品、血沉棕黃層、血卡、唾液、口腔抹拭物、糞便、固體或液體細菌培養(yǎng)物、NPA、再生加工用水（recreationalwater)和土壤。[0023]本文使用的術(shù)語"核酸"是指單獨的核酸和聚合鏈核酸，包括DNA和RNA，不管是天然存在的還是人工合成的（包括其類似物），還是它們的修飾物，特別是已知在自然中發(fā)生的那些修飾物，具有任意的長度。符合本申請的核酸長度的示例包括但不限于適合于PCR產(chǎn)物（例如約30至3000個堿基對（bp)，約30至2000bp，約30至1000bp)、長度為50至600bp的DNA片段、長度為100至350bp的DNA片段、以及人類基因組DNA(例如從約數(shù)十個千堿基對（Kb)至十億個堿基對（Gb)的級別）的長度。因此，應當理解的是，術(shù)語"核酸"涵蓋單個核酸以及核苷酸、核苷（天然的或者人工的以及它們的組合）的小片段的鏈，例如表達序列標簽或者基因組片段以及較大的鏈例如基因組材料，包括個體基因和甚至是整個染色體。本文使用的術(shù)語"低分子量（LffM)DNA"是指各種不同實施方式中的具有小于約20kb、15kb、IOkb、5kb、3kb、2kb、Ikb、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、4000bp、350bp或300bp的長度的DNA片段。本文使用的術(shù)語"高分子量（HMW)DNA"是指各種不同實施方式中的具有大于約300bp、350bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、Ikb、2kb、3kb、5kb、IOkb、15kb、20kb、50kb、或IOOkb的長度的DNA片段。在一些實施方式中，術(shù)語"高分子量DNA"是指大小范圍為等于或者大于3000bp、等于或者大于2000bp、等于或者大于lOOObp、等于或者大于800bp、等于或者大于600bp、等于或者大于500bp、等于或者大于400bp、或者等于或者大于350bp的DNA;而術(shù)語"低分子量DNA"是指大小范圍為小于或者等于3000bp、小于或者等于2000bp、小于或者等于lOOObp、小于或者等于800bp、小于或者等于600bp、小于或者等于500bp、小于或者等于400bp、小于或者等于350bp、或者小于或者等于300bp的DNA。在一些實施方式中，術(shù)語低分子量DNA是指在母親循環(huán)（例如血液）中存在的胎兒DNA，而術(shù)語"高分子量DNA"是指母系DNA。[0024]本文使用的術(shù)語"整體（monolith)吸附劑"或者"整體吸附材料"是指呈單件形式的具有連續(xù)的相互連接的孔隙結(jié)構(gòu)的多孔性三維吸附材料，其可以包括剛性、自支持的基本為整體的結(jié)構(gòu)。整體是例如通過將前體鑄造、燒結(jié)或聚合成具有所需形狀的模制品來制備。術(shù)語"整體吸附劑"或"整體吸附材料"意指區(qū)別于被填充成床形式或者嵌合到多孔性基質(zhì)中的各個吸附顆粒的集合，其中終產(chǎn)品包括各個吸附顆粒。術(shù)語"整體吸附劑"或"整體吸附材料"還意指區(qū)別于吸附性纖維或被吸附劑涂覆的纖維的集合，例如過濾紙或者涂覆有吸附劑的過濾紙。[0025]討濾器和務液器吸頭[0026]本發(fā)明的過濾器吸頭系統(tǒng)提供了一種核酸提取技術(shù)，利用該技術(shù)可以將整體結(jié)合基質(zhì)過濾器插入到移液器吸頭中。多孔性整體材料特異性地結(jié)合核酸并且由剛性的自支持的基本為整體的結(jié)構(gòu)組成。在一些實施方式中，所述多孔性整體材料不包括提供核酸親和性的額外材料。在一些優(yōu)選的實施方式中，所述多孔性整體材料是玻璃基整體材料，例如玻璃熔塊。在一些實施方式中，所述玻璃熔塊是燒結(jié)玻璃熔塊。所述多孔性整體材料例如玻璃熔塊或燒結(jié)玻璃熔塊的孔隙度取決于用途。一般來說，所述多孔性整體材料應當具有這樣的孔隙度，該孔隙度允許具有用于特定用途的所需樣品流速，并且能夠保留具有所需尺寸范圍的核酸。在一些實施方式中中，所述多孔性整體材料是具有范圍為2-400微米、2-300微米、2-220微米、2-200微米、2-180微米、2-160微米、2-140微米、2-120微米、2-100微米、2-80微米、2-60微米、2-40微米、2-20微米、2-16微米、2-10微米、2-5.5微米、4-400微米、4-300微米、4-220微米、4-200微米、4-180微米、4-160微米、4-140微米、4-120微米、4-100微米、4-80微米、4-60微米、4-40微米、4-20微米、4-16微米、4-10微米、4-5.5微米、10-400微米、10-300微米、10-220微米、10-200微米、10-180微米、10-160微米、10-140微米、10-120微米、10-100微米、10-80微米、10-60微米、10-40微米、10-20微米、10-16微米、16-400微米、16-300微米、16-220微米、16-200微米、16-180微米、16-160微米、16-140微米、16-120微米、16-100微米、16-80微米、16-60微米、16-40微米、40-400微米、40-300微米、40-220微米、40-200微米、40-180微米、40-160微米、40-140微米、40當前第1頁1 2 3 4 5 6