一種以多拉菌素為內標物使用液質聯用儀檢測羊肌肉組織中伊維菌素殘留量的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸藥殘留檢測方法領域，特別是涉及到對羊肌肉組織中殘留的伊維菌 素進行檢測的方法。
【背景技術】
[0002] 伊維菌素（Ivermectin，簡稱為IVM)是一種新大環(huán)內脂類抗生素，阿維菌素 (Avermectins)的第二代衍生物，它與阿維菌素的驅蟲機制相同，都是通過加強r一氨基丁 酸（GABA)的作用來實現，GABA是一種抑制性神經遞質，在大腦GABA主抑制突觸后神經傳 導，GABA的釋放量增加，是突觸后細胞的正常休止位能提高，神經難以將刺激傳遞給肌肉， 肌肉不能收縮，寄生蟲麻痹而被驅除，是阿維菌素家族中最優(yōu)秀的驅蟲藥之一，在畜牧業(yè)生 產中得以廣泛的應用。伊維菌素在農牧業(yè)廣泛用作抗寄生蟲劑和殺螨劑，該類藥物具有神 經和發(fā)育毒性，世界衛(wèi)生組織將其歸為高毒化合物。由于脂溶性好、代謝慢，長期大量非合 理使用該類藥物，會在動物體內造成高殘留，從而對人類健康產生巨大的影響。目前，以羊 肌肉組織內伊維菌素殘留的檢測方法為研究對象的相關報道相對較少；國內用于伊維菌素 殘留檢測的方法主要有以高效液相色譜為基礎的液相色譜紫外線檢測法（HPLC-UV)、液相 色譜熒光檢測法（HPLC-FLD)與免疫親和色譜技術（IAC);酶聯免疫（ELISA)等。
[0003] 現有技術當中的液相色譜法：是使用液相色譜儀進行組分分離，以紫外分光光度 計為檢測器檢測各組分的含量。由于伊維菌素分子結構中具有共輒二烯結構，在245nm波 長處有強的紫外吸收，在此光譜區(qū)域存在著脂類、皮質激素、維生素、核酸等眾多內源性物 質，紫外檢測器的靈敏度太低，易受雜質干擾，所以高效液相色譜紫外線檢測法（HPLC-UV) 已無法滿足目前農產品中阿維菌素及其有毒代謝物的殘留分析要求。
[0004] 現有技術當中的酶聯免疫吸附法：利用抗原與抗體的特異性、可逆性結合反應為 基礎，依靠比色來確定藥物殘留情況的檢測方法，目前已有部分特異性的酶聯免疫試劑盒 投入使用，但是，免疫分析檢測具有一定的盲目性，我國市場上酶聯免疫法成品試劑盒大多 從國外進口，酶聯免疫法的應用范圍受到較大的限制。
[0005] 現有技術當中的液相色譜熒光檢測法：是利用液相色譜對化合物進行分離， 然后利用化合物的紫外或熒光特性進行定性定量鑒定，特別是液相色譜-熒光檢測法 (HPLC-FLD)，具有選擇性好、靈敏度高、成本相對較低且易于推廣等特點，檢出限可達lppb， 但這種檢測方法需要進行衍生化，操作復雜，不適合進行大量的實用性檢測。
[0006] 現有技術當中的液相色譜質譜檢測法，多采用外標法定量。質譜檢測器的檢測較 靈敏，許多因素會造成檢測的不準確性，這些容易引起色譜峰面積不穩(wěn)定，造成定量不準確 等問題。如GB/T21320-2007等，其批內變異系數< 20%批間變異系數< 30%，變異較大。
[0007] 現伊維菌素殘留檢測凈化技術中，多采用乙腈飽和正己烷的液-液萃取法和C18柱、中性氧化鋁柱和堿性氧化鋁柱的固相萃取法。乙腈飽和正己烷的液-液萃取法，伊維菌 素微溶于正己烷，在去除雜質的同時也會有一定量伊維菌素的損失。GB/T21320-2007則選 用了（：18和C8固相萃取柱進行雙重凈化，操作程序復雜繁瑣。

【發(fā)明內容】

[0008] 針對現有技術存在的不足，本發(fā)明解決的技術問題為：提供一種用于羊肌肉組織 中伊維菌素殘留的檢測方法，通過對現有前處理技術的優(yōu)化和細化，獲得了良好的富集凈 化效果，通過加入多拉菌素內標，進行液相色譜-串聯質譜法檢測，提高了檢測方法靈敏 度、重復性和準確度，適合大批量樣品檢測。
[0009] 本發(fā)明實現上述目的所采用的技術方案如下： 一種以多拉菌素為內標物使用液質聯用儀檢測羊肌肉組織中伊維菌素殘留量的方法， 包括如下步驟： 步驟一、提取 稱取剪碎混勻的新鮮羊肌肉組織2. Og至50mL離心管中，加8mL乙腈，高速勻漿lmin， 禍旋振蕩2min，超聲5min，4000r/min離心10min，取上清液；再用8mL乙腈洗滌勾衆(zhòng)刀頭， 洗滌液禍旋振蕩2min，超聲5min，4000r/min離心10min，取上清液；合并上清液，得到提取 液； 步驟二、固相萃取 向堿性氧化鋁固相萃取柱中添加無水硫酸鈉 2g，先用IOml乙腈過柱活化，再將步驟一 中的提取液過柱，保持流速在1~I. 5mL/分鐘，再用3mL乙腈洗柱，收集全部流出液，氮氣 吹干； 步驟三、進樣 步驟二吹干得到的殘渣用1.0 mL乙腈溶解，再加入50 μ L濃度為Wg/mL的多拉菌素 內標液，渦旋30s，過0. 22 μ m濾膜后，上液質聯用儀進行檢測； 步驟四、標準曲線的制備 分別準確量取一系列濃度的伊維菌素標準工作溶液，依次加入到空白羊肌肉組織，再 按步驟一至三處理，繪制標準曲線； 采用內標法定量，根據步驟三和步驟四的結果計算羊肌肉組織中伊維菌素的含量。
[0010] 進一步，液相色譜條件為：CS柱；流動相A:乙腈，流動相B :含0. lvt%甲酸的 lOmmol/L乙酸銨水溶液，按VA:VB=90 :10比例混合；流速：0. 2mL/min ;柱溫：25°C ;進樣 量：5μL。
[0011] 本發(fā)明的優(yōu)點和產生的有益效果是： 本方法采用多拉菌素作為伊維菌素的內標物，消除檢測中各種因素的干擾，利于準確 定量。本方法根據伊維菌素的分子結構、物化特性以及堿性氧化鋁柱特點，采用雜質吸附模 式（乙腈溶解-乙腈洗脫-收集乙腈流出液和乙腈洗脫液）即收集所有流出液，反相吸附原 理，堿性氧化鋁固相萃取柱在無水的弱極性溶劑乙腈中，通過表面鋁原子中心與帶高負電 荷的雜原子如氧原子形成較強的極性作用力，選擇吸附極性較強的脂肪等雜質，收集所有 流出液，從而有效去除雜質干擾，提高羊肌肉組織中殘留伊維菌素的富集和凈化效率。
[0012] 本發(fā)明方法具有檢測限低，靈敏度高，變異系數低，測定結果準確可靠的優(yōu)點，適 合實驗室中大批量羊肌肉組織中伊維菌素殘留的檢測。
【附圖說明】
[0013] 圖1伊維菌素（a)與多拉菌素（b)的化學結構圖。
[0014] 圖2是本發(fā)明的實施例一中的（羊肌肉組織添加20ng/mL伊維菌素標準溶液樣品 與50 μ L多拉菌素內標液（Wg/mL))檢測目標物的色譜圖。
[0015] 圖3是多拉菌素（a)與伊維菌素（b)的質譜圖。
[0016] 圖4是不同離子源去溶劑氣溫度對離子加合物形態(tài)的影響。
[0017] 圖5是伊維菌素的標準曲線。
【具體實施方式】
[0018] 以下對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優(yōu)選實施例僅用 于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0019] 主要材料與試劑： 針筒式微孔濾膜過濾器（〇. 22 μ m，有機系）：天津津騰實驗設備有限公司； 乙腈、甲酸和乙酸銨：色譜純，美國fisher公司； 無水硫酸鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司； 屈臣氏純凈水：屈臣氏公司； 固相萃取小柱：堿性氧化鋁小柱，美國sepax公司； 伊維菌素標準品：含量99. 5%，中國食品藥品檢定研究院； 內標物多拉菌素：含量96. 0%，德國DrEhrenstorferGmbH。
[0020] 主要儀器與設備： 安捷倫1200-6410液質聯用儀（HPLC-MS/MS):美國Agilent公司； 高速勻漿機：江蘇金壇市榮華儀器公司； KL512型氮吹儀：北京康林科技有限責任公司； 湘儀離心機：湘儀公司； 禍旋振蕩器：HerosBIO, RS_2shaker ; KQ-600DE型超聲清洗儀：昆山超聲清洗儀器廠。
[0021] 實施例1不同離子源去溶劑氣溫度對離子加合物形態(tài)的影響 ESI離子源為軟電離方式，伊維菌素在ESI離子源內通常與H+，Na+，NH/等結合而形成 準分子離子峰，其中，[M+Na]+離子結構穩(wěn)定，若對其進行二級質譜裂解，不易得到碎片離 子，且H+，NH4+等可競相與目標分子結合，從而引起[M+Na] +離子豐度極不穩(wěn)定，所以質譜檢 測時多選用[M+NH4]+為母離子。
[0022] -、液相色譜與質譜條件 1、液相色譜條件 分析柱：安捷倫ZORBAXEclipSePlusCs柱；流動相A:乙腈，流動相B :含0. 1%甲酸(體 積百分數）的IOmmoVL乙酸銨水溶液；流速：0. 2mL/min ;柱溫：25°C ;進樣量：5μL。
[0023] 2、質譜條件 電噴霧離子源（ESI)，正離子模式，動態(tài)多反應監(jiān)測（DynamicMRM)方式采集，毛細管電 壓4kV，碰撞氣（N2)流速10L/min，霧化器壓力30psi。
[0024] 二、實驗步驟 選用不同離子源去溶劑氣溫度，150 °C、200 °C、250 °C、300 °C和350 °C，使用質譜的全掃 描模式，進樣伊維菌素標準溶液，觀察不同離子源去溶劑氣溫度下伊維菌素母離子加合物 形態(tài)，伊維菌素的[M+Na]+母離子峰為m/z897. 5, [M+NH4]+母離子峰為m/z892. 5。
[0025] 三、結果 實驗結果如圖4所示，圖4